去透明帶倉鼠卵母細胞穿透試驗

1、去透明帶倉鼠卵母細胞穿透試驗去透明帶倉鼠卵母細胞穿透試驗人精子與倉鼠卵母細胞融合的過程在功能上同與人卵母細胞融合的過程是一樣的，因為與卵母細胞質(zhì)膜融合的過程都是通過質(zhì)膜覆蓋在已發(fā)生頂體反應(yīng)的人精子赤道段而啟動的。倉鼠卵母細胞穿透（HOP）試驗，或稱精子穿透試驗，由于去除了透明帶，因此它不等同與生理狀態(tài)。此試驗的標準方案見后。注釋：注釋：常規(guī)穿卵試驗是依賴精子的自發(fā)性頂體反應(yīng)而實現(xiàn)的，這需要延長精子在體外的孵育時間。由于此步驟不如生理過程

2、有效，且可能涉及不同的機制，因此常常出現(xiàn)假陰性結(jié)果（病人的精子在倉鼠卵母細胞穿透試驗中失敗，而在體內(nèi)或體外可使人的卵母細胞授精，WHO，1986）。盡管如此，穿卵試驗仍可以反應(yīng)獲能精子頭部質(zhì)膜與卵細胞膜發(fā)生融合能力的信息。繼精子透明帶之間的相互作用后，引起頂體反應(yīng)的細胞內(nèi)信號是鈣內(nèi)流和胞漿堿化，兩者均可由二價陽離子載體A23187人工誘發(fā)。另一種方法是使用A23187激發(fā)的精子，該方法在文中亦有所描述。4.5.1實驗方案實驗方案4.5.

3、1.1試劑試劑1BWW儲存液：見附錄4，A4.1節(jié)。2透明質(zhì)酸酶（300500IUmg）。3Ⅰ型胰酶（10000BAEEUmg）。4蠟塊（融點為4866℃）。5凡士林6礦物油7去除透明帶的倉鼠卵：可購買商品化的卵或通過對倉鼠超排卵獲得。（見框4.1）8二甲基亞砜（DMSO）。9鈣離子載體（用于可選擇方案）1mm儲存液。4.5.1.2不用鈣離子載體的標準方案不用鈣離子載體的標準方案1將精液標本混合均勻。（見框2.3）2用密度梯度離心法（見

4、5.5節(jié)）或上游法處理精液標本（見5.4節(jié)）。3棄去大部分上清液，留下沉淀。12將精子液滴用礦物油覆蓋，詳細描述見4.5.1.2步驟11。注：注：鈣離子載體處理的劑量效應(yīng)曲線有個體差異，因此最好兩個濃度的鈣離子載體都檢測。框4.1倉鼠誘導(dǎo)排卵倉鼠誘導(dǎo)排卵確保注射活體動物的流程都符合法律程序。準備好合適劑量的孕馬血清（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素溶液。小量分裝后儲存于20℃?zhèn)溆?。?jīng)腹腔注射30單位PMSG給未成熟倉鼠或動情期第一天的成熟

5、倉鼠。4872小時后，經(jīng)腹腔再注射40單位的hCG。用一只手抓住動物背部并向腹部上方拉緊腹部皮膚，另一只手拿一個帶21號針頭的1ml注射器將激素注入倉鼠腹腔（從髖關(guān)節(jié)上方進針）。注射每只動物都更換針頭，這樣易于穿透皮膚并減輕動物的不適。4.5.1.4收集卵巢收集卵巢1注射hCG后18小時內(nèi)，按照動物飼養(yǎng)使用委員會批準的方法處死動物以回收卵母細胞。2倉鼠腹部朝上放置，用95%（vv）酒精蘸濕腹部皮毛。3用齒鑷夾住皮膚，用剪刀剪開皮膚和肌肉

6、，暴露子宮及卵巢。4用95%酒精擦拭鑷子和剪刀，擦凈上面的毛發(fā)。5將小腸拉出腹腔，暴露雙角子宮。6用鑷子夾住雙角子宮的一邊，將其拉出腹腔外以暴露輸卵管、卵巢及卵巢韌帶。7持住子宮最遠端的位置，緊貼鑷子下方從子宮末端切斷。切下卵巢，放入裝有BWW液（37℃預(yù)溫）的Petri盤中。8以相同的方法收集另一個卵巢。4.5.1.5收集卵丘復(fù)合物收集卵丘復(fù)合物1在解剖顯微鏡下通過透視檢查卵巢，在輸卵管的膨大部位找到卵丘復(fù)合物。2用鑷子固定輸卵管，用