超促排卵周期卵泡發(fā)育特點(diǎn)及卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、本研究根據(jù)當(dāng)前卵泡發(fā)育和卵子成熟研究范疇內(nèi)的趨勢(shì)和國(guó)內(nèi)的研究基礎(chǔ)，以超排促排卵對(duì)卵泡發(fā)育的干預(yù)和影響、超排卵周期卵母細(xì)胞發(fā)育潛能預(yù)測(cè)以及卵巢低反應(yīng)發(fā)生機(jī)制為切入點(diǎn)，探討超促排卵周期卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟的特點(diǎn)及其相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步明確卵泡發(fā)育調(diào)控機(jī)理和提高ART的安全性和成功率提供依據(jù)。 第一部分:超促排卵周期卵泡液蛋白質(zhì)組學(xué)研究 研究目的:本研究的目的是通過(guò)研究超促排卵周期與自然周期卵泡卵泡液蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的改變，以助

2、于闡明在超排周期中卵泡發(fā)育的特點(diǎn)，以及進(jìn)一步探索超促排卵對(duì)卵泡發(fā)育的影響。 材料和方法:采集自然周期與超促排卵周期卵泡液各6例，用二維凝膠電泳分離蛋白質(zhì)組成分，銀染染色后用PD-Quest軟件分析數(shù)字化的凝膠圖像，找出超促排卵周期差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，采用膠內(nèi)酶解消化方法得到差異蛋白斑點(diǎn)多肽混合物，用基質(zhì)輔助激光解吸．串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。 結(jié)果:1.通過(guò)分析二維凝膠電泳圖譜，13個(gè)蛋白斑點(diǎn)在超促排卵周期卵泡液中表達(dá)量較

3、自然周期組增加或減少2倍以上，并經(jīng)Student's t-test檢驗(yàn)，表達(dá)量?jī)山M有顯著差異(P<0.05)。其中11個(gè)點(diǎn)在超排周期中表達(dá)水平上調(diào)，另2個(gè)點(diǎn)在超排周期中表達(dá)水平下調(diào)。2.通過(guò)膠內(nèi)酶解消化、基質(zhì)輔助．激光解離／離子-飛行時(shí)間質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜分析得到差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)的肽質(zhì)指紋圖譜，通過(guò)MASCOT搜索引擎在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，其中8個(gè)蛋白斑點(diǎn)成功得到鑒定。這些鑒定蛋白質(zhì)包括觸珠蛋白、富含亮氨酸a2糖蛋白、鋅-α2-糖

4、蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白，α1-抗胰蛋白酶，補(bǔ)體C3等。這些蛋白參與排卵、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、類(lèi)脂／類(lèi)固醇代謝等過(guò)程。3.分別用速率散射比濁法和westem印跡驗(yàn)證其中4個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)趨勢(shì)：觸珠蛋白、補(bǔ)體C3、轉(zhuǎn)鐵蛋白和僅卜抗胰蛋白酶，其表達(dá)趨勢(shì)與二維電泳結(jié)果一致。 結(jié)論:通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)發(fā)現(xiàn)在超促排卵卵泡發(fā)育與卵母細(xì)胞成熟存在差異，其中與排卵、免疫反應(yīng)、類(lèi)脂／類(lèi)固醇代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生異常變化，為進(jìn)一步探索超促排卵對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育和成

5、熟的影響提供了重要的線索。 第二部分:人卵泡液骨形成蛋白-15水平與超排卵周期卵母細(xì)胞發(fā)育研究 目的：研究卵母細(xì)胞來(lái)源因子骨形成蛋白-15(Bone morphogenetic orotein-15，BMP-15)在人卵泡液中的水平及其與卵母細(xì)胞質(zhì)量、發(fā)育能力和后續(xù)胚胎質(zhì)量的關(guān)系。 材料和方法：對(duì)79例因男性因素不孕的進(jìn)行卵胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)的患者，采用常規(guī)促超排卵方案，采集每位患者1.8～2.0cm卵泡

6、卵泡液一份，共采集79例行ICSI治療的患者的79個(gè)卵泡中的卵母細(xì)胞和卵泡液，卵母細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，評(píng)價(jià)其受精和胚胎發(fā)育情況。western blot法檢測(cè)卵泡液中的BMP-15水平；放免法檢測(cè)卵泡液雌二醇(Estradiol，E2)、孕酮(Progesterone，P4)和促性腺激素(Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)水平。 結(jié)果:卵母細(xì)胞按其后續(xù)受精、卵裂和胚胎發(fā)育情況分別進(jìn)行分組，受精組和卵裂組

7、卵母細(xì)胞卵泡液BMP-15水平顯著高于未受精和未卵裂的卵母細(xì)胞的卵泡液(P<0.05)。優(yōu)質(zhì)胚胎組卵母細(xì)胞卵泡液BMP-15水平顯著高于二級(jí)和三級(jí)胚胎(P<0.01)。卵泡液BMP-15和E2水平呈顯著性正相關(guān)(P<0.01)，與卵泡液FSH水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。 結(jié)論:卵泡液BMP-15水平可能是一個(gè)預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞質(zhì)量和后續(xù)胚胎發(fā)育能力的一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)。 第三部分:人卵泡液中BMP-15水平與卵巢低反應(yīng)研究

8、 目的：研究超排卵周期卵巢低反應(yīng)患者卵泡液中BMP-15、SCF的水平及其與妊娠結(jié)局之間的關(guān)系。 材料與方法：對(duì)90例因管性因素不孕而行進(jìn)行體外受精．胚胎移植(In VitroFertilization-Embryo Transfer，IVF-ET)的患者，采用本常規(guī)促超排卵方案，用Westem印跡方法測(cè)定取卵時(shí)各組卵泡液中BMP-15的水平，用ELISA法檢測(cè)卵泡液SCF水平。按取卵時(shí)卵泡發(fā)育數(shù)目不同，將卵巢對(duì)超排卵藥物的

9、反應(yīng)分為低反應(yīng)型(卵泡數(shù)43)、正常反應(yīng)型(卵泡數(shù)4.13個(gè))。將低反應(yīng)組和正常反應(yīng)組患者分別按卵泡液平均BMP．15或SCF水平將其分為高水平組和低水平組，比較其IVF-ET的結(jié)局。 結(jié)果：低反應(yīng)組卵泡液中BMP-15(1.11±O．12)顯著高于正常反應(yīng)組(0.96+0.11，P<0.01)，低反應(yīng)組平均SCF水平為164.83+23.97 pg／ml，也顯著高于正常反應(yīng)組139.88±11.24pg／ml，P<0.01。低