TL1A對人結(jié)腸成纖維細胞膠原代謝的影響和機制研究.pdf

1、腸纖維化是炎癥性腸病(inflammotory bowel disease，IBD)，尤其是克羅恩病(Crohn's disease，CD)嚴重的并發(fā)癥。目前認為腸纖維化是在易感基因基礎(chǔ)上，出現(xiàn)腸黏膜免疫失調(diào)與腸菌抗原相互作用，產(chǎn)生炎癥細胞浸潤，釋放的炎癥細胞因子和生長因子等激活腸間質(zhì)細胞產(chǎn)生膠原在腸壁沉積所導致。腸肌成纖維細胞是腸纖維化發(fā)生的關(guān)鍵細胞。轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β1是

2、腸肌成纖維細胞分泌的主要促纖維化細胞因子。TGF-β1/Smad3信號通路在腸纖維化進程中起到重要作用。體內(nèi)外實驗均證實發(fā)生纖維化的腸組織TGF-β1表達較正常腸組織顯著增高，其持續(xù)過度表達導致腸道中細胞外間質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的積聚、重塑。在膠原大量合成時TGF-β1抑制ECM降解酶，即基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和纖溶酶原蛋白酶的活性，通過刺激基質(zhì)金屬蛋

3、白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)的產(chǎn)生而抑制MMP的表達。
　　 腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule-1A，TL1A)是IBD的易感基因腫瘤壞死因子超家族成員15(tumor necrosis factor superfamily member 15，TNFSF15)的蛋白產(chǎn)物。TL1

4、A主要在內(nèi)皮細胞表達，近年研究表明其在黏膜固有層T淋巴細胞、單核細胞和DC中也有表達。TL1A可通過與主要表達在活化的T細胞的死亡受體3(deathreceptor3，DR3)結(jié)合，為T淋巴細胞的激活提供協(xié)同刺激信號，影響機體免疫調(diào)節(jié)，參與包括IBD在內(nèi)的多種炎癥性疾病。目前研究顯示，TL1A與UC相關(guān)腸纖維化有相關(guān)性。研究主要集中在TL1A調(diào)節(jié)腸粘膜炎癥與嚴重程度以及誘導腸纖維化的發(fā)生的體內(nèi)實驗，但沒有針對TL1A在IBD相關(guān)腸纖維化

5、作用的體外細胞實驗。為此，本實驗在于探索TL1A在體外對TGF-β1介導活化的腸成纖維細胞的膠原代謝的影響及機制。
　　 目的:探討TL1A在體外對腸成纖維細胞的膠原代謝的影響及其機制。
　　 方法:TL1A干預的外周血單個核細胞上清干預TGF-β1活化的CCD-18Co，實驗分組如下:①Control組，以含0％胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在外周血單個核細胞上清干預步驟加入無TL1A上清;②TL1A組，以含0％

6、胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在外周血單個核細胞上清干預步驟加入含TL1A上清;③TGF-β1組，以含TGF-β1的0％胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在外周血單個核細胞上清干預步驟加入無TL1A上清;④TL1A+TGF-β1組，以含TGF-β1的0％胎牛血清的MEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，在外周血單個核細胞上清干預步驟加入含TL1A上清。CCK-8法檢測TL1A促進外周血單個核細胞轉(zhuǎn)化的最適濃度;MMT法檢測TGF-β1活化CC

7、D-18Co的最適濃度;BrdU法檢測CCD-18Co增殖;流式細胞術(shù)分析細胞周期變化;采用單克隆抗體α-SMA行免疫細胞化學染色檢測活化的CCD-18Co;羥脯氨酸測定盒（消化法）測定CCD-18Co細胞培養(yǎng)液的羥脯氨酸含量;WesternBlot及real-timeQ-PCR技術(shù)分別檢測CCD-18Co的α-SMA、Ⅰ型膠原(CollagentypeⅠ，Col1)α2、Ⅲ型膠原(CollagentypeⅢ，C013)α1、MMP-3

8、、TIMP-1、TGF-β1、p-Smad3蛋白以及Col1α2、Col3α1、纖維連結(jié)蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、MMP-3、TIMP-1、TGF-β1、Smad3mRNA的表達。
　　 結(jié)果:①CCK-8法結(jié)果顯示:30ng/mlTL1A培養(yǎng)72h對外周血單個核細胞活力促進效果最為顯著。②MMT法結(jié)果顯示:20ng/mlTGF-β1培養(yǎng)24h對CCD-18Co活力促進效果最為顯著。③BrdU法檢測結(jié)果顯示，同Con

9、trol組相比，TL1A組、TGF-β1組DNA合成輕度升高，分別升至124.4％、105.2％,P＜0.05;TL1A+TGF-β1組則顯著促進CCD-18CoDNA合成，增殖率為178.1％，P＜0.05。④TL1A使CCD-18Co細胞周期S期細胞比例增加，G0/G1期和G2/M期細胞比例下降。⑤免疫細胞化學染色檢測結(jié)果顯示:TL1A組、TGF-β1組、TL1A+TGF-β1組CCD-18Co的α-SMA蛋白表達水平較Contro

10、l組增加(11.52±0.20，7.04±0.10，14.94±0.03vs3.49±0.35，P＜0.05)。⑥細胞培養(yǎng)液羥脯氨酸含量測定結(jié)果顯示:同Control組相比，TL1A組、TL1A+TGF-β1組羥脯氨酸含量輕度增加(10.51±0.28，11.15±0.24vs10.22±0.17，P＜0.05)，但Control組與TGF-β1組之間無明顯差異(10.06±0.18vs10.22±0.17,P＞0.05)。⑦Weste

11、rnblot和real-timeQ-PCR檢測結(jié)果顯示:與Control組相比，TL1A組、TGF-β1組、TL1A+TGF-β1組CCD-18Co中α-SMA、Col1α2、Col3α1、MMP-3、TIMP-1蛋白以及Col1α2、Col3α1、FN、MMP-3、TIMP-1mRNA表達水平明顯增加（蛋白:α-SMA:0.75±0.03,0.94±0.01,1.04±0.04vs0.48±0.02;Col1α2:0.43±0.01,

12、0.54±0.02,0.57±0.03vs0.19±0.05;Col3α1:0.45±0.02,0.41±0.02,0.59±0.03vs0.26±0.04;MMP-3:0.28±0.10,0.35±0.02,0.39±0.02vs0.19±0.03;TIMP-1:0.60±0.01,0.61±0.02,0.83±0.01vs0.31±0.01,P＜0.05;mRNA:Col1α2:2.63±0.33,2.80±0.27,2.52±0.

13、24vs1.00±0.39;Col3α1:1.31±0.24,1.23±0.15,2.60±0.29vs1.00±0.24;FN.2.36±0.38,1.56±0.46,5.01±0.38vs1.00±0.38;MMP-3:1.38±0.28,1.12±0.28,4.44±0.23vs1.00±0.23;TIMP-1:1.56±0.48,1.55±0.45,5.29±0.03vs1.00±0.56,P＜0.05)。⑧Westemblot

14、和real-timeQ-PCR檢測結(jié)果顯示:與Control組相比，TL1A組、TGF-β1組、TL1A+TGF-β1組CCD-18Co中TGF-β1、p-Smad3蛋白以及TGF-β1、Smad3mRNA表達水平明顯增加（蛋白:TGF-β1:0.48±0.02,0.80±0.04,0.89±0.03vs0.24±0.01;p-Smad3:0.92±0.02,0.89±0.05,1.33±0.03vs0.59±0.03,P＜0.05;m