沙利度胺對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞增殖活性及膠原代謝的影響.pdf

1、背景:病理性瘢痕和局限性硬皮病是一類以真皮細(xì)胞因子活性異常及連續(xù)產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白為特征的纖維化性疾病。主要是由于成纖維細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)和膠原蛋白合成、分泌紊亂以及過(guò)度沉積所造成。目前對(duì)這類疾病的治療和預(yù)防局限，效果較差。沙利度胺，被廣泛用于鎮(zhèn)靜催眠、睡眠誘導(dǎo)及妊娠止吐后因其明顯的致畸作用被停用。隨著沙利度胺能有效治療麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑的發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外已有研究證實(shí)沙利度胺具有抗血管生成、抗炎，免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)作用，主要通過(guò)抑制VEGF

2、、TNF-a因子影響細(xì)胞遷移、粘附凋亡，抑制腫瘤血管生成，在關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性骨髓瘤及一些難治性皮膚病中廣泛應(yīng)用。它能抑制滑膜成纖維細(xì)胞及膠原蛋白合成，并可通過(guò)抑制細(xì)胞增值、TGF-β1、TNF-α、VEGF及膠原的表達(dá)而具有抑制肝纖維化、肺纖維化的作用[1]。它能通過(guò)干擾p38/Smad3作用通路抑制TGF-β1處理的正常及瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞纖連蛋白產(chǎn)生，可以證實(shí)沙利度胺具有抗瘢痕形成的潛在作用[2]。這些研究大多是從抑制炎癥因子活性，干

3、擾通路等方面進(jìn)行闡述，但對(duì)其作用于真皮成纖維細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)直接影響的研究甚少，本課題通過(guò)研究沙利度胺對(duì)正常真皮成纖維細(xì)胞增殖及主要細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的直接影響，為今后其對(duì)活化后成纖維細(xì)胞影響的研究奠定理論基礎(chǔ)，初步探討沙利度胺的抗真皮纖維化的潛在作用，為防止術(shù)后瘢痕形成及硬皮病的臨床治療提供新的指導(dǎo)思路。
　　目的:探索沙利度胺對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞的增殖活性及膠原表達(dá)的影響，及膠原代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:

4、r>　　1、使用含體積分?jǐn)?shù)20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，通過(guò)消化-組織塊混合法進(jìn)行人正常真皮成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，并通過(guò)對(duì)波形蛋白免疫組化染色，進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　2、CCK-8法檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖
　　實(shí)驗(yàn)用第4代成纖維細(xì)胞。細(xì)胞消化后按相同密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每組均設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。分別在每組中加入含有濃度分別為0（空白對(duì)照組）、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L含沙利度胺

5、的DMEM培養(yǎng)基(標(biāo)為A0、A-4、A-5、A-6、A-7)。同時(shí)設(shè)立調(diào)零孔，調(diào)零組只加空白培養(yǎng)基，用CCK-8法檢測(cè)沙利度胺作用24h后細(xì)胞在560nm處的光密度值（OD值），判斷在不同的濃度下，沙利度胺對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞增殖的影響，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　3、westernblot及熒光定量PCR法測(cè)定Col1-a1蛋白及其mRNA表達(dá)水平，以及膠原蛋白合成相關(guān)調(diào)節(jié)因子(TGF-β1、MMP-1、TIMP-1)mRN

6、A的表達(dá)情況。
　　成纖維細(xì)胞經(jīng)傳代后隨機(jī)分為5組，分別加入含沙利度胺濃度為0、10-4mol/L，10-5mol/L，10-6mol/L，10-7mol/L的培養(yǎng)基，每組設(shè)三個(gè)樣本。均接種在25mL培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。24h后提取各組總RNA。應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)Col1-a1、TGF-β1、MMP-1、TIMP-1基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。同樣分組，接種于75ml培養(yǎng)瓶，24h提取各組總蛋白，蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、加抗體并進(jìn)行化學(xué)發(fā)

7、光和圖像相對(duì)定量分析，應(yīng)用westernblot法對(duì)Col1-a1進(jìn)行蛋白水平測(cè)定。
　　4、ELISA法檢測(cè)TGF-β1分泌量并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　離心收集以上PCR各組細(xì)胞上清，通過(guò)ELISA法檢測(cè)成纖維細(xì)胞外TGF-β1分泌情況。所得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、CCK-8的結(jié)果顯示:5個(gè)處理組的細(xì)胞活性不全相等，即不同濃度沙利度胺對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，（組間比較F=18.

8、023，P＜0.05），組內(nèi)比較時(shí)，A組中，A-4A-5A-6能抑制細(xì)胞增殖，且兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A-7與對(duì)照組A0之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。沙利度胺10-4、10-5、10-6藥物濃度與細(xì)胞活性符合直線負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R=-0.972,P=0.028＜0.05。
　　2、Col1-a1蛋白及其mRNA表達(dá)水平，以及TGF-β1、MMP-1、TIMP-1的mRNA數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如下:沙利度胺不同濃度組處理正常成纖維細(xì)

9、胞24h后，COL1-A1mRNA及其蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組內(nèi)兩兩比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。相關(guān)分析表明:藥物濃度與Col1-a1表達(dá)符合直線負(fù)相關(guān)，PCR檢測(cè)中相關(guān)系數(shù)R=-0.972，western中相關(guān)系數(shù)R=-0.984，P＜0.05。
　　不同濃度組沙利度作用于正常成纖維細(xì)胞后，TGF-β1mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組內(nèi)比較時(shí)

10、，除A-6和A-7外的任兩組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A-5時(shí)抑制作用最明顯。MMP-1mRNA表達(dá)均有不同程度的升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且兩兩比較各濃度組之間具有顯著性差異(P＜0.05)。TIMP-1mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組降低，且差異顯著(P＜0.05)，組內(nèi)多重比較時(shí)除A-4和A-5之間無(wú)顯著性差異外，其余任處理組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、ELISA法測(cè)定TGF-β1實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析如下:A-

11、4、A-5較空白對(duì)照組分泌量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。但A-4、A-5組內(nèi)比較兩者并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、正常人真皮成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)成功，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，且波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性
　　2、CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示THD作用于人正常真皮成纖維細(xì)胞時(shí)，10-4、10-5、10-6能抑制細(xì)胞增殖，其藥物濃度與細(xì)胞活性符合直線負(fù)相關(guān)。但10-7濃度時(shí)對(duì)正常成纖維細(xì)胞增殖無(wú)影響。
　　3、