兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞壓力仿生培養(yǎng)及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的:本研究擬通過體外壓力培養(yǎng)平臺(tái)，分析不同壓力梯度下角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及其生物學(xué)功能的變化規(guī)律。探討正常眼壓對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性的正向調(diào)節(jié)作用，為建立旨在提高角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量的三維仿生培養(yǎng)系統(tǒng)提供理論依據(jù)，構(gòu)建工程化角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植膜。闡明病理性高眼壓下角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷的病理基礎(chǔ)和調(diào)控環(huán)節(jié)，為青光眼治療策略中的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 第一部分角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的改良將帶有兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞的后

2、彈力層完整撕下，胰蛋白酶-EDTA聯(lián)合酶化，純化的角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，描記細(xì)胞生長(zhǎng)倍增曲線。神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。蘇木素-伊紅(HE)染色以及茜素紅-臺(tái)盼蘭聯(lián)合染色分析細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞體外生長(zhǎng)過程中Annexin V-PE的表達(dá)情況，透射電鏡和掃描電鏡進(jìn)行細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)的觀察。 第二部分角膜內(nèi)皮細(xì)胞壓力仿生培養(yǎng)的研究設(shè)計(jì)并制作自動(dòng)充壓范圍為O～60mmHg的壓力維

3、持培養(yǎng)裝置，測(cè)定預(yù)設(shè)壓力的維持時(shí)間，確定自動(dòng)充壓的時(shí)間點(diǎn)。將接種了傳代角膜內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)板放入壓力預(yù)設(shè)為2KP(14.66mmhg)的壓力維持培養(yǎng)裝置中，進(jìn)行持續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的形態(tài)，形成單層的時(shí)間，描記細(xì)胞倍增曲線。形成單層后茜素紅-臺(tái)盼蘭聯(lián)合活性染色評(píng)價(jià)細(xì)胞活性，正常壓力培養(yǎng)過程中，激光共焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞連接蛋白ZO-1表達(dá)部位和表達(dá)強(qiáng)度，評(píng)價(jià)細(xì)胞間連接功能的建立情況。免疫熒光法追蹤C(jī)aspase-3表達(dá)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)壓力培養(yǎng)下

4、AnnexinV—PE陽性細(xì)胞的比例。 第三部分三維壓力仿生培養(yǎng)構(gòu)建工程化角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植膜胰酶消化去除羊膜上皮細(xì)胞，保留基底膜作為載體，接種純化兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞，在壓力培養(yǎng)系統(tǒng)中，進(jìn)行三維仿生培養(yǎng)，構(gòu)建工程化角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植膜。HE染色，電鏡觀察構(gòu)建移植膜的組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)，免疫熒光分析ZO-1蛋白的表達(dá)。 第四部分高壓力作用下角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制研究增壓培養(yǎng)裝置內(nèi)給予持續(xù)高壓3.2kp～4.6kp(24.06mmhg～3

5、4.59mmhg)、5.4kp～6.8kp(40.60mmhg～51.29mmhg)，觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)以及增殖活性的變化，評(píng)估角膜內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)活性與壓力強(qiáng)度以及持續(xù)時(shí)間的相關(guān)性，檢測(cè)早期凋亡因子Caspase-3、AnnexinV的表達(dá)規(guī)律。 結(jié)果: 1.后彈力層撕除聯(lián)合酶消化法獲得大量純化的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，快速貼壁生長(zhǎng)并增殖，體外培養(yǎng)3～4 d即融合成單層細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶抗體陽性，HE染色及活性染色提

6、示細(xì)胞功能良好。 2.生理壓力環(huán)境培養(yǎng)下的角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)活性良好，細(xì)胞立體感強(qiáng)、外形扁平，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞膜及交界區(qū)ZO-1蛋白高水平表達(dá)，更接近機(jī)體生理狀態(tài)下生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。生理壓力下未見明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。 3.壓力培養(yǎng)系統(tǒng)中，角膜內(nèi)皮細(xì)胞接種于脫細(xì)胞羊膜后，快速生長(zhǎng)并增殖，3～4d即融合成單層，其形態(tài)及生長(zhǎng)密度優(yōu)于單純培養(yǎng)皿上培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。HE染色及電鏡顯示構(gòu)建的工程化內(nèi)皮植片具有與生理角膜內(nèi)皮組織相近的組

7、織結(jié)構(gòu)。 4.高壓環(huán)境下培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞，增殖緩慢，胞體大而透明，胞漿內(nèi)含較多的顆粒，細(xì)胞間隙增寬。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，Caspase-3、AnnexinV表達(dá)增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞比例顯著增加。 結(jié)論: 1.角膜后彈力層撕除聯(lián)合酶消化法可提高角膜內(nèi)皮細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)效率，該方法提取的角膜內(nèi)皮細(xì)胞純，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，同時(shí)減少了上皮、基質(zhì)引起細(xì)胞性污染的風(fēng)險(xiǎn)，為工程化角膜內(nèi)皮移植膜的構(gòu)建提供穩(wěn)定的種子細(xì)胞來源

8、。 2.低壓力仿生培養(yǎng)環(huán)境，對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的功能有正向調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)體外培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞之間連接功能的建立，為工程化角膜內(nèi)皮移植膜的構(gòu)建提供了新的環(huán)境模式誘導(dǎo)平臺(tái)。 3.低壓力三維仿生培養(yǎng)系統(tǒng)中，以脫細(xì)胞羊膜為載體，可構(gòu)建細(xì)胞密度、形態(tài)以及組織結(jié)構(gòu)與生理內(nèi)皮相似的工程化內(nèi)皮細(xì)胞移植膜，為角膜內(nèi)皮細(xì)胞移植研究進(jìn)行了前期技術(shù)儲(chǔ)備。 4.高壓力對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞有損傷作用，通過引起細(xì)胞凋亡的途徑來實(shí)現(xiàn)，呈現(xiàn)出時(shí)間-量效曲線，Ca