Rock2通過調(diào)控MMP2泛素化降解促肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、研究背景和目的：
　　Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶2（Rock2）屬于Rho家族的下游效應(yīng)蛋白，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是主要參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的一種金屬蛋白酶。本研究主要探討原發(fā)性肝癌組織及肝癌細(xì)胞中Rock2和MMP2表達(dá)及其關(guān)聯(lián)情況，并研究Rock2在MMP2介導(dǎo)的肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、采集77例患有原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的肝癌組織及癌旁

2、組織，通過運(yùn)用qRT-PCR、Western Blot等方法檢測肝癌組織及癌旁組織Rock2和MMP2蛋白的表達(dá)水平，并通過統(tǒng)計(jì)分析兩者的相關(guān)性。
　　2、通過熒光定量和Western Blot檢測肝癌細(xì)胞HCCLM3、MHCC97H、SMCC7721、HepG2、Huh-7及正常肝細(xì)胞HL7702中Rock2和MMP2的mRNA和蛋白表達(dá)情況。我們構(gòu)建了4個shRock2干擾質(zhì)粒，并將我們構(gòu)建的4個干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，利用熒

3、光定量PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染48h后Rock2蛋白和mRNA的表達(dá)變化；將篩選出的最佳shRock2干擾質(zhì)粒和Rock2特異性抑制劑(Y27632)轉(zhuǎn)染到人肝細(xì)胞癌HepG2和HCCLM3中，通過運(yùn)用熒光定量PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞中Rock2、MMP2 mRNA和蛋白表達(dá)變化；并且運(yùn)用transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察干擾Rock2和加入Rock2特異性抑制劑(Y27632)處理后肝癌細(xì)

4、胞侵襲遷移能力的變化；利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株建立人肝癌裸鼠皮下瘤模型，觀察荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)Rock2和MMP2蛋白表達(dá)情況及荷瘤裸鼠出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移情況；
　　3、通過Western Blot、免疫共沉淀、激光共聚焦確定MMP2和Ub的相互作用及Rock2通過調(diào)節(jié)MMP2的泛素化及其降解促進(jìn)原發(fā)性肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示，在肝癌組織中Rock2和MMP2 mRNA

5、表達(dá)顯著高于癌旁組織，Western Blot分析結(jié)果表明，77.92％（60／77）的患者肝癌組織中Rock2蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，62.34%（48／77）的患者肝癌組織中MMP2蛋白也明顯高于癌旁組織。而且，通過散點(diǎn)圖分析發(fā)現(xiàn)Rock2和MMP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。另外，通過Western Blot和RT-PCR檢測正常肝細(xì)胞HL-7702和五株不同肝癌細(xì)胞株中Rock2和MMP2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有肝癌

6、細(xì)胞株中Rock2和MMP2的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯比正常的肝細(xì)胞升高，且其表達(dá)趨勢較一致。
　　2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Rock2最佳干擾shRNA至HepG2和HCCLM3肝癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)Rock2蛋白的表達(dá)明顯下降（p<0.05），同時發(fā)現(xiàn)MMP2基因蛋白表達(dá)也隨之下降（p<0.05）；Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示降低Rock2表達(dá)后，HepG2和HCCLM3細(xì)胞侵襲遷移能力明顯減弱（P<0.05），過表達(dá)MMP2則可以反

7、轉(zhuǎn)干擾Rock2導(dǎo)致的侵襲遷移能力下降；利用人肝癌裸鼠皮下腫瘤模型發(fā)現(xiàn)干擾Rock2蛋白表達(dá)能減少裸鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移（p<0.05）。3、通過免疫共沉淀和激光共聚焦等實(shí)驗(yàn)證實(shí)MMP2是通過泛素化降解。同時，證實(shí)Rock2通過調(diào)節(jié)MMP2的泛素化及其降解穩(wěn)定MMP2的表達(dá)來影響肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：
　　Rock2能促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移，其機(jī)制是通過干擾MMP2的泛素化降解。為MMP2的控制確定了一種新