miR-let-7a通過降低PKM2表達抑制胃癌細胞增殖、遷徙和轉(zhuǎn)移.pdf

1、胃癌是世界范圍內(nèi)死亡率第三位的惡性腫瘤。中國是世界上胃癌發(fā)病率最高的國家之一，其病死率居惡性腫瘤的第三位，嚴重威脅人類的生命與健康。正常分化的細胞主要通過有氧氧化功能，與之相比，腫瘤細胞以有氧糖酵解作為主要的供能方式（瓦伯格效應）。
　　丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)是催化糖酵解最后一步反應的關鍵酶，它將磷酸烯醇式丙酮酸分解成為丙酮酸。PK在體內(nèi)有四種活性形式，其中PKL和PKR由同一基因PKLR編碼，通過不同

2、的組織特異性啟動子分別表達于肝臟和紅細胞中。而PKM1主要表達于骨骼肌和腦組織，PKM2主要表達于胚胎組織及增殖的細胞，尤其是腫瘤細胞中。PKM2主要以2種形式存在，即高活性的四聚體形式和低活性的二聚體形式。四聚體型存在于分化的組織和正常增殖的細胞中，而二聚體型存在于腫瘤細胞中，與底物親和力低，促使腫瘤細胞內(nèi)糖代謝中間體如磷酸烯醇類物質(zhì)等累積，它將糖酵解途徑阻斷在丙酮酸上游，使中間產(chǎn)物聚集，促進大分子物質(zhì)合成，有利于腫瘤生長，對腫瘤細胞

3、的增殖及血管新生具有重要作用。
　　miR-let-7a是早期發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，也是線蟲時序性發(fā)育的關鍵性調(diào)控因子，其不僅在哺乳動物中調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡，也在細胞周期調(diào)節(jié)中起關鍵作用，對包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤都有抑制作用。我們擬通過從let-7a入手，分析其在胃癌細胞中與PKM2可能的作用機制，研究let-7a/PKM2通路參與胃癌細胞發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制。
　　目的：
　　明確let-7a和PKM2在胃癌

4、組織及細胞中的表達差異及相關性，重點探討let-7a調(diào)控PKM2對胃癌細胞株增殖、遷徙和轉(zhuǎn)移能力的影響及相關分子機制，分析let-7a/PKM2通路在胃癌細胞生長中的作用，其結果將有助于進一步了解let-7a/PKM2信號通路在胃癌生長過程中的作用和分子機制，對探索非編碼RNA在胃癌發(fā)病機制與信號通路的交互調(diào)控作用有重要意義，可能為未來胃癌分子治療提供新思路。
　　方法：
　　1、在人類胃癌組織和癌旁組織以及胃癌細胞株中測定

5、let-7a和PKM2表達水平，并進行病理特征分析。
　　2、分別構建let-7a過表達和干擾慢病毒表達系統(tǒng)，收獲重組慢病毒感染胃癌細胞株。實時定量PCR、western blot明確let-7a的過表達和干擾后，下游c-Myc，hnRNPA1和PKM2的含量變化，CCK-8，Transwell遷徙和轉(zhuǎn)移等細胞功能實驗檢測let-7a對胃癌細胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3、分別構建PKM2過表達和干擾慢病毒表達系統(tǒng)，收

6、獲重組慢病毒干擾胃癌細胞株。
　　4、實時定量PCR、western blot明確PKM2的過表達和干擾后，上游let-7a，c-Myc和hnRNPA1的含量變化，CCK-8，Transwell遷徙和轉(zhuǎn)移等細胞功能實驗檢測PKM2對胃癌細胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　5、裸鼠體內(nèi)實驗進一步驗證let-7a/PKM2通路對胃癌細胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　結果：
　　1、胃癌組織和胃癌細胞中l(wèi)et-7a表

7、達與PKM2表達呈負相關;
　　2、let-7a通過調(diào)節(jié)c-Myc，hnRNPA1的表達進而影響胃癌細胞中PKM2表達;
　　3、let-7a抑制胃癌細胞增殖以及遷徙轉(zhuǎn)移能力;
　　4、let-7a最終是通過影響PKM2表達抑制胃癌細胞增殖和遷徙轉(zhuǎn)移能力;
　　5、裸鼠實驗在體內(nèi)水平證實let-7a/PKM2通路對胃癌生長能力的抑制作用。
　　結論：
　　Let-7a通過影響c-Myc和hnRNPA1