?；撬犷A(yù)處理對(duì)大鼠移植肝臟缺血再灌注后Kupffer細(xì)胞IRAK-4信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：1.探討建立穩(wěn)定的大鼠肝移植（liver transplantation）動(dòng)物模型的方法和手術(shù)技巧，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供能夠長(zhǎng)期存活的穩(wěn)定的肝移植動(dòng)物模型。2.觀察?；撬犷A(yù)處理后Sprague-Dawley（SD）大鼠移植肝臟的轉(zhuǎn)氨酶，Kupffer細(xì)胞（KCs）的白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-4（IRAK-4）及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵核因子NF-κB表達(dá)水平，KCs上清液腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量和移植肝臟的病理表現(xiàn)的變化，探討牛

2、磺酸預(yù)處理抑制肝臟缺血再灌注損害（IRI）的相關(guān)機(jī)制。 方法：1.采用稍加改良的Kamada“二袖套法”建立大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，即采用端-端連續(xù)縫合法吻合肝上下腔靜脈，用二袖套法吻合門(mén)靜脈及肝下下腔靜脈，膽總管用內(nèi)支架法完成膽道重建，肝動(dòng)脈結(jié)扎不予重建。術(shù)后觀察大鼠的存活率和生存質(zhì)量，總結(jié)手術(shù)技巧、經(jīng)驗(yàn)和方法，掌握成熟穩(wěn)定的大鼠原位肝移植動(dòng)物模型技術(shù)。2.雄性SD大鼠128只，完全隨機(jī)化分為生理鹽水對(duì)照組（NS組）和?；撬犷A(yù)

3、處理組（Tau組），采用上述方法建立肝移植動(dòng)物模型。NS組切取供肝前10min經(jīng)腰靜脈注射生理鹽水1.5ml；Tau組切取供肝前10min經(jīng)腰靜脈注射?；撬幔?00mmol/L）1.5ml。于再灌注后0、60min及180min，分別活殺8只取外周血漿和分離培養(yǎng)再灌注后KCs，采用蛋白免疫印記法（Western blotting）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorogenetie quantitative PCR）測(cè)定

4、KCs中的IRAK-4蛋白和mRNA表達(dá)水平；凝膠電泳遷移率分析法（EMSA）檢測(cè)KCs的NF-κB活性；酶連免疫吸附測(cè)定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)培養(yǎng)上清液中TNF-α含量；全自動(dòng)血清自動(dòng)生物化學(xué)儀檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶。另每組留8只術(shù)后大鼠觀察1w生存情況，并處死存活7d的大鼠取肝臟標(biāo)本光鏡切片HE染色檢測(cè)組織形態(tài)學(xué)改變。 結(jié)果：1.通過(guò)手術(shù)操作訓(xùn)練，建立起穩(wěn)定的大鼠原位

5、肝移植實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。NS組和Tau組兩組間手術(shù)時(shí)間、供肝冷保存時(shí)間、受體無(wú)肝期時(shí)間相比無(wú)顯著差異。2.血清ALT、AST檢測(cè)：NS、Tau組間相比較，NS組血清ALT術(shù)后60min和180min分別為652.88±162.76U/L和986.25±173.59U/L，血清AST術(shù)后60min和180min分別為1578.0±369.64U/L和2125.3±303.46U/L±Tau組術(shù)后60min和180min血清ALT分別為434.25

6、±112.27U/L和535.375±183.23U/L，Tau組術(shù)后60min和180min血清AST分別為1088.38±258.73U/L和1201.63±298.67U/L，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；0min時(shí)相點(diǎn)比較兩組無(wú)顯著性差異。3.KCs中IRAK-4mRNA和蛋白表達(dá)量的變化：NS組KCs中IRAK-4mRNA和蛋白表達(dá)量在60min、180min分別為5.44±1.04、3.95±0.98和3.52±0

7、.81、3.26±0.62；Tau組KCs中IRAK-4mRNA和蛋白表達(dá)量在60min、180min分別為2.39±1.11、1.53±0.48和1.67±0.37、1.49±0.19；Tau組術(shù)后60min和180min的IRAK-4mRNA和蛋白表達(dá)量均明顯低于NS組術(shù)后同一時(shí)相點(diǎn)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而0min時(shí)相點(diǎn)則無(wú)顯著性差異。4.KCs中NF-κB表達(dá)水平的變化：NS組NF-κB在術(shù)后60min、180

8、min分別為530.19±53.24和449.87±41.58；Tau組NF-κB在術(shù)后60min、180min分別為333.96±36.43和279.69±35.49，Tau組術(shù)后60min和180minKCs中NF-κB表達(dá)水平均明顯低于NS組術(shù)后同一時(shí)相點(diǎn)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而0min時(shí)相點(diǎn)則無(wú)顯著性差異。5.KCs培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量變化：NS組TNF-α的含量于60min和180min分別為134

9、9.27±189.67μg/L和398.61±43.28μg/L；Tau組TNF-α的含量于60min和180min分別為674.18±85.32μg/L和43.28±9.78μg/L，NS組與Tau組在術(shù)后60min和180min比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：1.?；撬犷A(yù)處理能夠有效地減輕肝移植大鼠血清ALT和AST，起到有效地抑制移植肝臟的缺血再灌注損傷的作用。2.牛磺酸預(yù)處理可通過(guò)IRAK-4途徑抑制移