慢病毒法建立表達外源基因的人前列腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株.pdf

1、研究背景:
　　 癌癥極大的威脅著人類的健康，前列腺癌是成年男性最常見的惡性腫瘤之一，在美國，其發(fā)病率居男性惡性腫瘤首位，在我國，其發(fā)病率也逐年上升。在對前列腺癌治療研究過程中存在著一些難題:包括前列腺癌診斷困難以及晚期前列腺癌特別是雄激素非依賴型前列腺癌缺乏有效的可靠的治療方法。腫瘤的基因治療策略是通過轉(zhuǎn)入外源基因，激活胞內(nèi)的相關(guān)凋亡通路進而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡達到消滅或縮小瘤體的療效。腫瘤基因療法一些優(yōu)點包括靶向性強，對晚期腫

2、瘤有效，全身治療等。然而，基因治療也存在著一些難題:凋亡難以持續(xù)激活，外源基因轉(zhuǎn)入困難以及缺乏檢測手段等。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要通路，其中p38作為該家族的亞族之一，參與了細(xì)胞內(nèi)如應(yīng)激反應(yīng)、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程。在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程中，目前研究發(fā)現(xiàn)多種治療基因通過p38MAPK通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡。因此我們設(shè)計將外源性的p38MAPK導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并使細(xì)胞穩(wěn)定持續(xù)表達，觀察該

3、基因過表達時對細(xì)胞生長增殖的影響，同時為未來通過該通路的治療靶點研究提供了工具。
　　 將外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞并使其表達的過程中，外源性目的基因的攜帶載體選擇成為最關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。目前基因治療中轉(zhuǎn)入基因的載體大體上可以分為兩大類:即病毒載體和非病毒載體。非病毒載體常用的方法包括電轉(zhuǎn)移法、磷酸鈣共沉淀法以及脂質(zhì)體法，可以達到瞬時表達的效果。但瞬時表達系統(tǒng)的外源基因表達會隨細(xì)胞生長繁殖而逐漸降低，且無法傳至子代細(xì)胞。病毒載體目前常用

4、的包括腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體以及慢病毒載體。其中慢病毒載體改造自逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有以下特點:第一、慢病毒載體既能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞又能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞;第二、目的基因高效的整合于宿主細(xì)胞基因組內(nèi)實現(xiàn)長期而穩(wěn)定的表達并可以傳代給子代細(xì)胞;第三、不會引起宿主免疫反應(yīng);第四，去除了原病毒復(fù)制的關(guān)鍵位點，提高了生物安全性。
　　 對于前列腺癌的動物實驗中，如何監(jiān)測腫瘤細(xì)胞或者腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展的過程成為亟待解決的問題，目前常見的方法包括熒光蛋

5、白法和生物發(fā)光法。熒光蛋白作為報告基因，在生物學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，成為細(xì)胞內(nèi)分子影像的主流技術(shù)。其中遠紅色熒光蛋白(far-redfluorescentprotein)因其激發(fā)和發(fā)射波長較長，細(xì)胞內(nèi)成像背景低而成為生物發(fā)光研究領(lǐng)域的新熱點。螢光素酶(luciferase)是一類在有O2及ATP存在下，催化特定底物產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其發(fā)光強度與腫瘤細(xì)胞數(shù)目、存活率而且與生長狀態(tài)相關(guān);最有代表性的是螢火蟲螢光素酶(Firefly

6、luciferase，F(xiàn)luc)，可準(zhǔn)確定位腫瘤灶，作為報告基因提供了對腫瘤早期、快速、準(zhǔn)確、動態(tài)的監(jiān)測手段。
　　 綜上所述，本文包括兩個部分，第一部分是利用慢病毒載體技術(shù)，構(gòu)建包含p38目的基因的慢病毒載體，建立穩(wěn)定、持續(xù)表達p38蛋白的前列腺細(xì)胞株;第二部分采用慢病毒法構(gòu)建表達雙報告基因即:紅色熒光蛋白-螢火蟲熒光素酶(RFP-FLUC)的前列腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株，并探索其在構(gòu)建裸鼠前列腺皮下模型中的應(yīng)用。
　　 （一）

7、p38絲裂原激活蛋白激酶基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其在建立人前列腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株中的應(yīng)用
　　 1.研究目的:
　　 本研究將構(gòu)建及鑒定p38MAPK基因重組慢病毒載體，包裝慢病毒后轉(zhuǎn)導(dǎo)前列腺癌DU145細(xì)胞株，建立穩(wěn)定表達外源性EGFP/p38融合蛋白的人前列腺癌DU145單克隆細(xì)胞株EGFP/p38-DU145，初步探索p38對該細(xì)胞株生長的影響，從而為p38MAPK的功能及通過p38MAPK通路作用的相關(guān)基因的進一步

8、研究提供工具。
　　 2.研究方法:
　　 2.1慢病毒載體pTYF-EF1α-EGFP/p38構(gòu)建及鑒定
　　 利用酶切、回收片段、再連接的方法構(gòu)建慢病毒載體，將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取若干單克隆接種于特異性的抗性培養(yǎng)基中，提取重組載體質(zhì)粒，以pEGFP/p38質(zhì)粒作為對照，雙酶切鑒定重組載體。
　　 2.2慢病毒包裝和滴度測定
　　 按LipofectaminTM2000說明書

9、psPAX2、pMD2.G及慢病毒載體（以pTYF-EF1α-EGFP載體作為對照）三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞上清，3000r/min4℃離心15min后于-80℃中保存病毒液。采用終點稀釋法測病毒滴度(TU/ml)。病毒滴度的計算公式為病毒滴度(TU/ml)=陽性細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)。
　　 2.3慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DU145細(xì)胞
　　 向細(xì)胞內(nèi)加入總體積300μl，含100μl上述包裝好的病毒上清(MOI=1

10、0)及polybrene(8μg/ml)的全培，24h后更換為500μl不含病毒液的全培，72h后觀察細(xì)胞熒光發(fā)光。
　　 2.4單克隆細(xì)胞株的建立
　　 采用有限稀釋法建立單克隆細(xì)胞株。96孔板中每孔加100μl含有單細(xì)胞的細(xì)胞懸液。常規(guī)培養(yǎng)20天后選取生長狀態(tài)良好陽性克隆孔，然后逐級擴大培養(yǎng)。
　　 2.5Westernblotting檢測重組細(xì)胞株總p38的表達
　　 共納入三種細(xì)胞:EGFP/p3

11、8-DU145細(xì)胞、EGFP-DU145細(xì)胞、正常DU145細(xì)胞RIPA裂解液裂解細(xì)胞后，收集上清于-20℃保存，常規(guī)方法對樣品進行Westernblotting檢測。
　　 2.6細(xì)胞生長觀察
　　 分別消化EGFP/p38-DU145細(xì)胞、EGFP-DU145細(xì)胞及正常DU145細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后于24孔板內(nèi)每孔接種1×104個細(xì)胞，每種細(xì)胞接種4塊板，每板接種24個孔。之后每隔24h分別于各板內(nèi)隨機取3孔的細(xì)胞進行單

12、盲計數(shù)并計算每板細(xì)胞數(shù)的平均值，連續(xù)計數(shù)8d后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計;利用3種細(xì)胞每天測量的細(xì)胞數(shù)的平均值繪制生長曲線。
　　 2.7統(tǒng)計學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，運用重復(fù)測量分析方法分別比較實驗組EGFP/p38-DU145細(xì)胞與對照組EGFP-DU145細(xì)胞之間的生長速度是否具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05為差異有顯著性。
　　 3.研究結(jié)果:
　　 3.1慢病毒載體的鑒定
　　 慢病毒載

13、體pTYF-EF1α-EGFP/p38經(jīng)SalI和NheI雙酶切后在1％瓊脂糖凝膠電泳中條帶，其中可見大小約為1.7kb和5.5kb的條帶，對照載體pEGFP/p38經(jīng)雙酶切后可見約1.7kb和3.0kb的條帶，均與預(yù)計結(jié)果符合，證實載體構(gòu)建成功。
　　 3.2慢病毒包裝及滴度測定
　　 轉(zhuǎn)染后24h，在熒光顯微鏡下觀察幾乎所有293T細(xì)胞均發(fā)出亮度較高的綠色熒光，利用終點稀釋法稀釋終點為105孔和106孔，計數(shù)兩孔內(nèi)分

14、別共44和5個陽性細(xì)胞，故計算慢病毒滴度為(44×105+5×106)/2=4.7×106TU/ml。
　　 3.3慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DU145細(xì)胞
　　 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DU145細(xì)胞72h后熒光顯微鏡白光下下觀察其成上皮細(xì)胞形態(tài)，生長狀態(tài)良好。在激發(fā)光下，部分整合了EGFP/p38融合基因的DU145細(xì)胞能發(fā)出綠色熒光，熒光較均勻的分布于整個細(xì)胞，慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高。
　　 3.4單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株建立
　　 有限

15、稀釋法選取的一株細(xì)胞，成上皮細(xì)胞形態(tài)與正常的未經(jīng)處理的DU145細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上沒有明顯差異，其生長狀態(tài)良好，所有細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光，熒光較均勻地分布于整個胞漿。將其擴大培養(yǎng)后保存，命名為EGFP/p38-DU145。
　　 3.5Westernblotting檢測EGFP/p38-DU145細(xì)胞株總p38的表達
　　 三株細(xì)胞的內(nèi)參表達量基本一致;在39kD附近，3株細(xì)胞均出現(xiàn)深淺程度相近的條帶，說明3組細(xì)胞均表達內(nèi)源性

16、的p38蛋白，表達量沒有明顯差異;同時EGFP/p38DU145細(xì)胞株還出現(xiàn)了大小60kD左右的條帶，為外源性的EGFP/p38融合蛋白，其表達量較高。
　　 3.6細(xì)胞生長觀察
　　 較用同樣方法轉(zhuǎn)入外源EGFP基因的對照組EGFP-DU145細(xì)胞株，表達外源性p38的EGFP/p38-DU145細(xì)胞株生長速度明顯減慢(P＜0.05)，說明過表達p38MAPK對于DU145細(xì)胞的增殖能力具有抑制作用。
　　 4

17、.研究結(jié)論
　　 在本實驗中，我們成功構(gòu)建p38MAPK重組慢病毒載體并利用該載體技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)DU145細(xì)胞;然后通過有限稀釋法使細(xì)胞單克隆化，進而在熒光顯微鏡下選擇熒光強度較高的單克隆株并通過Westernblotting進行表達鑒定，得到了穩(wěn)定、高效、均一地表達外源性p38的前列腺癌細(xì)胞株;發(fā)現(xiàn)過表達p38的DU145細(xì)胞盡管在細(xì)胞形態(tài)上沒有發(fā)生顯著改變，但其生長受到明顯抑制，這種抑制作用因為p38蛋白的穩(wěn)定過表達而長期存在。<

18、br>　　 （二）慢病毒法建立穩(wěn)定表達雙報告基因的人前列腺癌細(xì)胞株
　　 1.研究目的:
　　 建立同時穩(wěn)定表達螢火蟲熒光素酶(FLUC)和遠紅色熒光蛋白(RFP)雙報告基因的人前列腺癌DU145細(xì)胞株，體外觀察該細(xì)胞株生長特性及熒光素酶發(fā)光特性，繼而利用該細(xì)胞建立裸鼠前列腺皮下瘤體模型，觀察其體內(nèi)成瘤后的生長及發(fā)光特性，為后續(xù)的研究工作提供良好的工具。
　　 2.研究方法:
　　 2.1慢病毒包裝及滴

19、度測定
　　 按照LipofectaminTM2000的操作說明書，將載體psPAX2、載體pMD2.G及慢病毒載體plenti-cmv-Fluc-2A-mKate-cgk-puro三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞上清，3000r/min4℃離心15min后于-80℃中保存病毒液。采用終點稀釋法測病毒滴度(TU/ml)。病毒滴度的計算公式為病毒滴度(TU/ml)=陽性細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)。
　　 2.2DU14

20、5細(xì)胞培養(yǎng)與puromycin最佳篩選濃度確定
　　 DU145細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)并加入濃度分別為1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml、6ug/ml的puromycin，設(shè)置3個復(fù)孔及空白對照，每天觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每2-3天更換含有上述濃度梯度的培養(yǎng)基。
　　 2.3慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DU145細(xì)胞
　　 轉(zhuǎn)導(dǎo)前1天取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的DU145細(xì)胞接種于24孔板中，轉(zhuǎn)導(dǎo)時加入總體積300

21、ul，含100ul病毒液(MOI=6)及polybrene(8ug/ml)的全培，24小時后更換為500ul不含病毒液的全培，72小時后觀察細(xì)胞熒光發(fā)光。
　　 2.4單克隆細(xì)胞株的建立
　　 向轉(zhuǎn)導(dǎo)后的DU145細(xì)胞添加并每2-3天更換含有濃度2ug/ml的puromycin的完全培養(yǎng)基，每天觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光發(fā)光情況，至大部分無抗性細(xì)胞死亡;然后利用有限稀釋法挑選生長狀態(tài)良好、熒光強度較高的陽性克隆孔，在含濃度2ug

22、/ml的puromycin的完全培養(yǎng)基繼續(xù)擴大培養(yǎng)。
　　 2.5陽性克隆細(xì)胞株體外生長及熒光素酶發(fā)光特性觀察:
　　 取陽性克隆Fluc-mKate-DU145以及普通DU145細(xì)胞分別消化后計數(shù)，細(xì)胞計數(shù)后于24孔板內(nèi)每孔接種1×104個細(xì)胞，每種細(xì)胞接種4塊板，每板接種24個孔。之后每隔24h分別于各板內(nèi)隨機取3孔的細(xì)胞進行單盲計數(shù)并計算每板細(xì)胞數(shù)的平均值，連續(xù)計數(shù)8d后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用2種細(xì)胞每天測量的細(xì)胞數(shù)的

23、平均值繪制生長曲線。Fluc-mKate-du145細(xì)胞，以1x104-8x104個細(xì)胞每孔倍比稀釋接種于96孔板中，在活體成像系統(tǒng)中觀察單克隆細(xì)胞株發(fā)光特性，測量每孔相對光子數(shù)并比較與細(xì)胞數(shù)的關(guān)系。
　　 2.6裸鼠皮下移植瘤的建立
　　 共8只約六周齡的雄性裸鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi)，隨機分為實驗組和對照組，每組4只做好標(biāo)記;分別消化計數(shù)Fluc-mKate-DU145以及普通DU145細(xì)胞，并重懸于PBS內(nèi)，每只鼠

24、右側(cè)臀部皮下注射100ul含有2×106個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，其中實驗組注射細(xì)胞為Fluc-mKate-DU145細(xì)胞，對照組為普通DU145細(xì)胞。動物飼養(yǎng)至2月時處死，解剖皮下移植瘤，制作病理切片并進行HE染色后于顯微鏡下觀察。
　　 2.7瘤體體內(nèi)生長觀察及熒光素酶發(fā)光特性觀察
　　 自肉眼可見的皮下腫瘤形成開始，每3天測量各只裸鼠皮下腫瘤的長徑與短徑計算腫瘤體積，同時在活體成像系統(tǒng)中觀察其發(fā)光強度變化，至動物處死后停止

25、觀察。
　　 2.8統(tǒng)計學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，運用重復(fù)測量分析方法分別比較陽性克隆Fluc-mKate-DU145與對照組普通DU145細(xì)胞在體外生長速度是否具有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05為差異有顯著性;比較體外生長時發(fā)光強度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。
　　 3.研究結(jié)果:
　　 3.1慢病毒包裝及滴度測定
　　 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后24小時在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，幾乎所有293T細(xì)胞均

26、發(fā)出亮度較高的紅色熒光，說明轉(zhuǎn)染效率較高，病毒包裝成功。經(jīng)過抗生素篩選2周后，在10-5孔內(nèi)共出現(xiàn)28個陽性克隆，10-6孔內(nèi)共出現(xiàn)3個陽性克隆，故計算慢病毒滴度為(28*105+3*106)/2=2.9×106TU/ml。
　　 3.2慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DU145細(xì)胞
　　 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)DU145細(xì)胞72小時后熒光顯微鏡下觀察成上皮細(xì)胞形態(tài)，生長狀態(tài)良好。在激發(fā)光下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，整合了目的基因的DU145細(xì)胞能發(fā)出高亮度

27、的紅色熒光，熒光較均勻的分布于整個細(xì)胞，能較好地顯示細(xì)胞的形態(tài)輪廓。
　　 3.3單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株建立
　　 有限稀釋法鋪板后20天，在96板中的挑選出的一株單克隆細(xì)胞群落，該株細(xì)胞生長狀態(tài)較好，所有細(xì)胞均發(fā)出亮度較高的紅色熒光，將其逐級擴大培養(yǎng)后保存，命名為Fluc-mKate-du145。
　　 3.4Fluc-mKate-du145細(xì)胞株體外生長觀察及Fluc表達特性觀察
　　 連續(xù)10天每天分別記

28、錄Fluc-mKate-du145及正常DU145細(xì)胞株的細(xì)胞數(shù)并取三個孔平均值，利用重復(fù)測量的方差分析得到兩組細(xì)胞生長速度無顯著性差異(p＞0.1)。在活體成像系統(tǒng)(XenogenIVISTMLuminaImagingsystem)中觀察Fluc-mKate-du145發(fā)光情況，及各組的相對光子數(shù)測量值。利用相關(guān)分析，得出相對光子數(shù)測量值與細(xì)胞數(shù)呈線性關(guān)系(r=0.998，p＜0.05)。
　　 3.5裸鼠前列腺癌皮下模型的建

29、立及瘤體病理檢測
　　 在第三周觀察時，裸鼠皮下形成肉眼可見的腫瘤;動物處死時，大體觀察，可見實驗組與對照組腫瘤瘤體大小以及結(jié)構(gòu)相似，HE染色后顯微鏡下觀察瘤體細(xì)胞成典型的腺癌形態(tài)，與對照組相比沒有明顯差別。
　　 3.6皮下模型體內(nèi)瘤體生長觀察及熒光素酶發(fā)光特性觀察
　　 皮下腫瘤體積隨時間逐漸增大，活體成像系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)瘤體的發(fā)光強度隨時間逐漸增加。
　　 4.研究結(jié)論:
　　 本研究采用慢病毒技