人前列腺癌裸鼠模型的建立和應用.pdf

1、前列腺癌是歐美國家最常見的一種男性惡性腫瘤，近年來在我國該病的發(fā)病率也有明顯上升趨勢。臨床上40％的前列腺癌病人，在初診時或長期隨診后，會出現(xiàn)轉移癥狀。要能了解前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制，并有效設計合理的治療策略，首先要能建立能反應臨床前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉移的人前列腺癌研究模型。而目前我國已有的前列腺癌模型較少，尤其是關于原位前列腺癌模型方法更少，同時在分子水平上探討比卡魯胺治療前列腺癌的文章較少，因而系統(tǒng)建立各種前列腺癌模型并且比較他

2、們的差異，同時從分子水平上研究比卡魯胺對前列腺癌的作用，對于研究前列腺癌發(fā)生、發(fā)展轉移機制及開發(fā)新型抗前列腺癌藥物具有重大意義。 目的： 研究比卡魯胺對裸鼠移植前列腺癌的藥效作用并探討比卡魯胺治療前列腺癌的機制，同時建立多種前列腺癌皮下和原位模型。 方法： 1．對四種前列腺癌細胞(PC-3M、DU145、LNCaP和CWR22R-v1)進行細胞培養(yǎng)，分別注射入裸小鼠右側皮下，觀察腫瘤生長情況并測量腫瘤體積

3、，繪制生長曲線。同時系統(tǒng)比較DU145細胞和CWR22Rv1細胞皮下和原位移植后成瘤率、瘤重指數(shù)、淋巴結轉移率和生長曲線等。 2．我們分別采取CWR22Rv1細胞原位注射法、組織塊包埋法、組織塊懸掛法建立前列腺癌原位模型，觀察腫瘤生長情況并在裸鼠瀕臨死亡時處死裸鼠，測量腫瘤體積并稱瘤重，同時肉眼觀察淋巴結及臟器轉移情況。同時腫瘤、臟器和周圍淋巴結固定做病理觀察。 3．采用皮下組織塊移植法建立裸小鼠前列腺癌模型，每4d觀察

4、裸鼠腫瘤生長情況，并用游標卡尺測量裸鼠腫瘤的最長徑和最短徑，按照公式V=0.5ab<'2>計算腫瘤體積，式中V為腫瘤體積，a 為通過腫瘤中心量取的最長徑，b為通過腫瘤中心量取的最短徑。直至所有裸鼠腫瘤體積范圍為100mm<'3>～300mm<'3>，隨機分成4組：陰性對照組、比卡魯胺1mg/kg、5mg/kg和 25mg/kg劑量組，每組8只，開始按10ml/kg 的體積灌胃給藥。連續(xù)給藥30d；裸鼠體重每4d稱一次，且用游標卡尺測量裸

5、鼠長短徑，計算腫瘤體積并繪制生長曲線。停藥24小時后處死所有裸鼠，稱量裸鼠體重，取出皮下腫瘤，測量腫瘤長短徑，稱腫瘤體重，計算抑瘤率。 4．解剖時，福爾馬林固定腫瘤組織、重要臟器及淋巴結，切片，免疫組化SP法測定各組動物腫瘤的雄激素受體(AR)和增值細胞核抗原(PCNA) 的表達，了解比卡魯胺對裸鼠前列腺癌AR及PCNA表達的影響。 5．解剖時，各組裸鼠中取部分腫瘤迅速投入液氮罐中保存。選取比卡魯胺高劑量組腫瘤和對照組腫

6、瘤，用基因芯片法，尋求差異表達基因，并用實時定量RT-PCR法對差異基因進行驗證，了解比卡魯胺體內(nèi)對裸鼠前列腺癌在前列腺癌生物標記相關基因表達的影響。 結果： 1．本實驗表明各模型在裸鼠體內(nèi)生長速度為：CWR22Rv1細胞>PC-3M 細胞>DU145細胞>LNCaP細胞。無論是采取原位接種還是皮下接種法接種DU145細胞和CWR22Rv1細胞，裸鼠成瘤率都達到10/10，就腫瘤重量而言，皮下接種法所形成腫瘤要明顯大于原

7、位接種法。就局部淋巴結轉移來說，原位接種法產(chǎn)生轉移主要部位是腹腔內(nèi)淋巴結(主動脈旁淋巴結為主)，頸背部皮下接種法主要向腋窩、頸部等部位轉移。采用原位接種法CWR22Rv1細胞產(chǎn)生的淋巴結轉移率為9/10，而同樣的方法接種DU145細胞只產(chǎn)生1/lO的淋巴結轉移率。而采用皮下接種法兩種細胞均未檢測到任何淋巴結轉移。 2．三種方法均成功的建立了前列腺癌原位轉移模型。其中細胞接種法接種后14d可于下腹前列腺部觸及結節(jié)。48d后10只C

8、WR22Rv1組裸鼠都出現(xiàn)惡液質。10只CWR22Rv1移植裸鼠中有9只裸鼠腹主動脈旁均可見腫大的淋巴結，直徑約2mm，病理證實轉移。而包埋法接種后5d可于下腹前列腺部觸及結節(jié)。25d后10只裸鼠都出現(xiàn)惡液質，腫瘤平均重量(2910±350)g。而懸掛法接種后3d可于下腹前列腺部觸及結節(jié)，23d后10只裸鼠都出現(xiàn)惡液質，腫瘤平均重量(4302±390)g。10只裸鼠均發(fā)現(xiàn)有轉移的淋巴結。 3．接種后，成瘤率為100％；接種后第8

9、d，32 只裸鼠皮下腫瘤體積均在100mm<'3>～300mm<'3>之間。到給藥30d后，比卡魯胺低劑量組、中劑量組和高劑量組的腫瘤體積明顯小于陰性對照組(P<0.01)，瘤重量也低于對照組(P<0.01)，抑瘤率分別為10.77％、37.32％和63.28％。 4．免疫組化結果表明比卡魯胺高劑量組中PCNA 的表達量遠低于對照組(P<0.05)，AR 表達量也遠遠低于對照組(P<0.05)。 5．基因芯片技術檢測了比

10、卡魯胺高劑量組和對照組腫瘤在263個前列腺癌生物標記基因的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)有八種基因在比卡魯胺高劑量組腫瘤中表達水平與對照組的腫瘤表達有明顯差異。為驗證該結果的可靠性，我們使用實時定量RT-PCR 技術對其中三種差異性表達的基因在兩種細胞的表達進行了表達分析，結果與基因芯片結果基本一致。 結論： 1.PC-3M、DU145、CWR22Rv1、LNCaP 細胞接種到裸小鼠皮下均可建立前列腺癌動物模型。LNCaP細胞加入M

11、atrigel膠后才能形成前列腺癌皮下模型。CWR22Rv1 細胞原位接種法能獲得9/10淋巴結轉移率，高于DU145細胞(1/10)。 2．細胞注射法、組織包埋法和懸掛法都成功建立前列腺癌原位模型，成瘤率為100％。組織塊包埋法人為腹腔轉移少，是比較理想的方法。組織懸掛塊和細胞原位接種法較易導致人為腹腔轉移。 3．比卡魯胺高劑量組腫瘤重量低于對照組(P<0．01)，抑瘤率>40％。認為比卡魯胺高劑量組對CwR22Rv1

12、 細胞裸鼠前列腺癌有治療作用。比卡魯胺高劑量組能顯著降低PCNA和AR的表達(相對于陰性對照組)。 4．在體內(nèi)，比卡魯胺能夠下調八種前列腺癌相關基因的表達。這些基因大部分已公認與前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關。提示比卡魯胺可能通過降低裸鼠移植前列腺癌這些相關基因的表達，從而降低前列腺癌的種植能力、侵襲性，改變其生物學特質和行為，達到抑制前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展的目的。 5．這些結果再次證實了“種子與土壤”學說，并且成功用 4