兩種異基因造血干細(xì)胞移植后嵌合體檢測方法的建立和對照研究.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是目前許多惡性血液病和一些非惡性疾病的主要治療手段，但疾病的復(fù)發(fā)仍是影響allo-HSCT效果的主要原因。成功的移植是一個復(fù)雜的過程，移植后區(qū)分造血細(xì)胞是來源于供者還是受者很重要，對于臨床判斷是否植入、疾病復(fù)發(fā)以及干預(yù)性免疫治療具有指導(dǎo)意義。移植后嵌合體的檢測有多種方法，目前常用的是建立在DNA多態(tài)性基礎(chǔ)上的PCR方法。其中利用短串連重復(fù)序列(STR)以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)等進(jìn)行嵌合體的檢

2、測已成為研究的熱點。國外目前以熒光標(biāo)記STR作為檢測嵌合體的主要方法，而國內(nèi)開展嵌合體檢測的研究是在近幾年，多以STR硝酸銀染色法為主。文獻(xiàn)對于這兩種檢測方法的敏感性報道不一，而關(guān)于這兩種方法的檢測敏感性、準(zhǔn)確性及結(jié)果穩(wěn)定性方面的對照研究報道極少。本研究以此為基礎(chǔ)，建立了STR銀染和熒光標(biāo)記多重STR全自動毛細(xì)管電泳兩種檢測移植后嵌合狀態(tài)的方法，并應(yīng)用到臨床。對比兩種檢測方法的敏感性、準(zhǔn)確性，以選擇更好的方法為臨床服務(wù)。并通過移植后嵌合

3、體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果與臨床病程進(jìn)展進(jìn)行比較，研究嵌合體檢測方法的實用性。 方法：(1)建立STR-PCR結(jié)合硝酸銀染色檢測嵌合體的方法。根據(jù)美國CODIS數(shù)據(jù)庫，選擇5個具有高度多態(tài)性STR位點和性別位點，設(shè)計并合成其特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色后通過凝膠成像分析軟件進(jìn)行嵌合體的檢測。(2)對2002年9月至2005年1月在解放軍總醫(yī)院行異基因造血干細(xì)胞移植的46例患者進(jìn)行嵌合體的動態(tài)監(jiān)測。(3)建立熒

4、光標(biāo)記多重STR毛細(xì)管電泳檢測嵌合體的方法。利用ABI公司的Profilerplus個體識別試劑盒進(jìn)行熒光標(biāo)記多重STR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI310遺傳分析儀進(jìn)行全自動毛細(xì)管自動電泳，數(shù)據(jù)經(jīng)GeneScan和Genotyper進(jìn)行自動分析，根據(jù)供受者峰面積比值進(jìn)行嵌合體的計算。(4)對上述46例患者中的30例采用毛細(xì)管電泳法動態(tài)監(jiān)測嵌合體的變化。(5)對兩種檢測方法的敏感性、穩(wěn)定性以及檢測結(jié)果等進(jìn)行比較。(6)對嵌合體的動態(tài)監(jiān)測與臨床病

5、程發(fā)展及轉(zhuǎn)歸進(jìn)行比較，研究嵌合體檢測方法的實用性。 結(jié)果表明：(1)兩種方法體外模擬混合樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線均顯示擴(kuò)增前供者DNA含量百分比與擴(kuò)增后供受者峰面積比值呈直線相關(guān)，因此都可用于嵌合體的檢測，但毛細(xì)管法的相關(guān)性更好。(2)銀染法混合樣本中能檢出的DNA最小含量百分比是5％～10％，25μl反應(yīng)體系中最小檢出模板量是5ng；熒光標(biāo)記多重STR毛細(xì)管電泳法混合樣本中能檢出的DNA最小含量百分比是2.5％～5％，50μl反應(yīng)體系中能

6、檢出的最小模板量是0.05ng。(3)兩種檢測方法的嵌合體動態(tài)監(jiān)測結(jié)果具有直線相關(guān)性，但毛細(xì)管電泳法準(zhǔn)確性及靈敏度均高于銀染法。(4)嵌合體的動態(tài)監(jiān)測結(jié)果基本與臨床發(fā)展及轉(zhuǎn)歸相符，對于臨床判斷疾病狀態(tài)及采取治療措施有指導(dǎo)意義。 結(jié)論：(1)STR銀染法和熒光標(biāo)記多重STR毛細(xì)管電泳法都可用于嵌合體的檢測，但毛細(xì)管法的準(zhǔn)確性和靈敏度要明顯高于銀染法。(2)銀染法對一些微量嵌合體的檢測結(jié)果欠佳，而毛細(xì)管電泳法檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，能夠