TGF-β-,1-基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合BMC-MSCs誘導(dǎo)嵌合體在異種心臟移植免疫耐受中作用的實驗研究.pdf

1、本課題克隆了大鼠TGF-β1基因，構(gòu)建了攜帶目的基因的重組紕逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并且在豚鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。通過多次輸注豚鼠骨髓細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞建立了一種穩(wěn)定的異基因大鼠嵌合體模型。探討聯(lián)合應(yīng)用嵌合體和TGF-βl逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療是否能夠在大鼠中誘導(dǎo)出異種心臟移植的免疫耐受，據(jù)此來評估TGF-Dl基因和嵌合體在異種移植中的應(yīng)用前景。 方法： 1、分離大鼠脾細(xì)胞，經(jīng)PHA(10μg/ml)活化24h后，提取細(xì)胞總R

2、NA，根據(jù)GenBank公布的大鼠TGF-BlcDNA序列設(shè)計并合成一對引物P1、P2，采用RT-PCR技術(shù)克隆大鼠TGF-βl基因，將RT-PCR產(chǎn)物亞克隆到pMDl8-T載體經(jīng)PCR鑒定陽性克隆，并將PCR產(chǎn)物用PstI單酶切鑒定和重組克隆載體進(jìn)行DNA測序鑒定。 2、以測序驗證的pMDl8-T／TGF-β1為模板，分別利用P3、P6；P5、P4二對引物PCR擴(kuò)增出目的基因片段PCRl和PCR2：再以PCRl、PCR2為模板

3、，利用P3、P4引物PCR擴(kuò)增出目的基因片段PCR3(基因內(nèi)PstI酶切位點ctgcag—ctgcaa同義點突變的大鼠TGF-p1)，經(jīng)雙酶切后正向插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pGEZ-Term構(gòu)建pGEZ-Term-TGF-βI，并經(jīng)PCR、雙酶切和DNA測序鑒定。 以測序驗證的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pGEZ-Term-TGF-pI與輔助病毒載體pHIT456和pHIT60混合后，脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染293T包裝細(xì)胞。利用CPE、GFP觀察和PC

4、R分析(重組)逆轉(zhuǎn)錄病毒在293T細(xì)胞中的包裝成熟和裂細(xì)胞釋放。 采用成年豚鼠用貼壁法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，觀察其生長和增殖特性，取第三代培養(yǎng)細(xì)胞做細(xì)胞生長曲線測定。 獲得的具有感染能力的成熟重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染骨髓MSCs，經(jīng)Zeocin篩選獲得抗性細(xì)胞株，熒光顯微鏡下觀察GFP在骨髓MSCs中的表達(dá)，并RT-PCR、PCR、Westernblot和ELISA檢測大鼠TGF-pI目的基因的轉(zhuǎn)錄、整合和表達(dá)。

5、 3、選用雄性豚鼠和雌性SD大鼠為供受體，隨機(jī)將36只大鼠分為六組：所有大鼠受體接受6~Co~射線全身照射，照射后4h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸注不同細(xì)胞，兩天后經(jīng)環(huán)磷酰胺注射處理。A組為對照組，輸注生理赫水；B組輸注豚鼠骨髓細(xì)胞(BMC)；C組輸注豚鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)。D組輸注轉(zhuǎn)染了TGF-Bl基因的豚鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs／TGF-pI)，E組和F組先輸注BMC，14天后再次輸注BM-MSCs和BM-MSCs／T

6、GF-Bl，所有細(xì)胞輸注量均為2×108，通過MLR、嵌合體的測定來探討耐受機(jī)制，并連續(xù)檢測了外周淋巴細(xì)胞的變化，流式細(xì)胞儀檢測了T淋巴細(xì)胞亞群的變化，用ELISA法檢測細(xì)胞移植后受體內(nèi)IFN-7和IL-4、IL．10細(xì)胞因子的表達(dá)。 4．豚鼠和大鼠作為供受體，隨機(jī)分為六組，A組(CVF，n=6)，B組(CVF+BMC，n=6)，C組(CVF+BM-MSCs，n=6)，D組(CVF+BM-MSCs／TGF-β1，n=6)，E組(

7、CVF+BMC+BM-MSCs，n=6)，F(xiàn)組(CVF+BMC+BM-MSCs／TGF-β1，n=6)。應(yīng)用Ono法行腹腔異種異位心臟移植，記錄移植物存活時間，檢測移植物病理組織學(xué)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果： 1、RT-PCR產(chǎn)物約1000多bp，與克隆的大鼠TGF-β1基因大小相一致；經(jīng)PCR鑒定RT-PCR產(chǎn)物已亞克隆于pMDl8-T克隆載體；PCR產(chǎn)物經(jīng)單酶切能釋放出約450bp和700bp大小的片段，表明其很有可能

8、是大鼠TGF-βl基因；DNA序列測定進(jìn)一步證實其為大鼠TGF-pl目的基因，所克隆的1153bp大鼠TGF-βI基因與GenBank報道的序列完全一致。 2、利用PCR法擴(kuò)增了PstI酶切位點ctgeg一ctgcaa同義點突變的大鼠TGF-p1基因，并構(gòu)建了pGEZ-Term-TGF-p1重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；經(jīng)CPE、GFP觀察和PCR鑒定表明在293T細(xì)胞中包裝獲得了具有感染能力的成熟重組逆轉(zhuǎn)錄病毒；全培養(yǎng)骨髓細(xì)胞并連續(xù)2～

9、3d換液，10-14天后貼壁的纖維狀細(xì)胞融合成片，得到梭形的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；經(jīng)GFP觀察、RT-PCR、PCR、Westernblot和ELISA檢測表明獲得了穩(wěn)定表達(dá)大鼠TGF-B1的轉(zhuǎn)基因MSCs。 3、在實驗組輸注BMC，BM-MSCs或BM-MSCs／TGF-βl后，混合嵌合體可以被檢測到，MLR顯示耐受大鼠呈供者特異性耐受。兩次注射者其MLR刺激效因較其他組明顯降低。外周淋巴細(xì)胞在全身輻照后下降，于第七天達(dá)到最低，隨

10、后逐漸升高到處理后35天僅升至正常水平的20％。T淋巴細(xì)胞亞群也呈明顯的降低，特別是CD3+在外周血中的比例。THl／TH2型細(xì)胞因子(如INF-~，IL-4andIL．10)在經(jīng)輸注TGF-βl基因轉(zhuǎn)染的BM-MSCs后，出現(xiàn)了兩類細(xì)胞因子的偏移。 4、移植物的平均存活時間：A組為310min、B組為37lmin、C組為320min、D組為33lmin，E組為55lmin，F(xiàn)組為633min。各組移植物病理表現(xiàn)均為急性血管性排

11、斥反應(yīng)(AVR)改變，E、F組移植物炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)減少。 結(jié)論： 1、成功克隆了大鼠TGF-p1基因和構(gòu)建了TGF-βl基因內(nèi)PstI酶切位點同義點突變的pGEZ-Term-TGF-pl。 2、貼壁法可用于分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：并獲得了以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)大鼠TGF-β1的骨髓MSCs。 3、通過在非清髓性法預(yù)處理后輸注供體骨髓細(xì)胞(BMC)或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)，可以建立混合嵌合