IL-35在急性移植物抗宿主病中的作用研究.pdf

1、一、小鼠IL-35的克隆及真核表達載體的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建小鼠IL-35單鏈融合基因及其真核表達載體。
　　方法：取小鼠脾細胞，體外LPS刺激6小時后提取總RNA，通過RT-PCR克隆小鼠EBI3和IL-12p35 cDNA；采用重疊延伸PCR，通過編碼疏水性多肽接頭(Gly4Ser)3的DNA序列連接小鼠EBI3基因和IL-12p35成熟肽基因，構(gòu)建小鼠IL-35單鏈融合基因，添加Igk信號肽及酶切位點，并將其克隆至pc

2、DNA3.1（+）載體。通過酶切和測序鑒定陽性重組載體。
　　結(jié)果：DNA序列分析結(jié)果表明：小鼠IL-35單鏈融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的連接順序、方向及序列完全正確。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了小鼠IL-35單鏈融合基因及其真核表達載體，為進一步探討IL-35的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　二、IL-35抑制急性移植物抗宿主病的作用及作用機制
　　目的：研究IL-35抑制急性移植物抗宿主病的作用

3、及作用機制。
　　方法：①建立 C57BL/6→BALB/c小鼠清髓性異基因骨髓移植 aGVHD模型。14只BALB/c小鼠經(jīng)預(yù)處理后隨機分為2組：實驗組水流動力學(xué)注射 IL-35質(zhì)粒（HGT/IL-35）；對照組水流動力學(xué)注射空質(zhì)粒（HGT/control）；各組小鼠于 HGT后24小時分別接受Co608.5 Gy全身照射，照射4小時后尾靜脈輸注1×107個骨髓細胞+5×106個脾細胞建立急性移植物抗宿主病模型。移植后觀察aGV

4、HD表現(xiàn)，Log-rank檢驗各組生存率；移植后10d取肺、肝臟、回腸進行病理組織學(xué)檢查，移植后10d嵌合度檢測。②應(yīng)用流式細胞儀檢測移植后10d脾、肝、肺、小腸淋巴細胞 CD3、CD4、CD8、CD44、CD62L、Gr1、CD19、NK1.1、CD11b、CD11c陽性細胞表達率；胞內(nèi)染色檢測移植后10d脾、肝、肺、小腸CD4+T淋巴細胞分泌IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ的比例及數(shù)量以及CD8+T淋巴細胞分泌IL-1

5、0、IL-17、TNF-α、IFN-γ的比例及數(shù)量；流式CBA檢測移植后第10天小鼠血清中的IL-10、IFNγ、TNFα、IL-6、IL-17水平。③流式細胞儀檢測移植后10d脾、肝、肺、小腸 CD4+FoxP3+T細胞、CD8+FoxP3+T細胞的比例及數(shù)量；BrdU摻入法檢測移植后10d脾、肝、肺、小腸CD4+、CD8+T細胞的增殖以及CD4+FoxP3+T細胞、CD8+FoxP3+T細胞的增殖。④建立體外混合淋巴細胞反應(yīng)（MLR

6、）體系，以BALB/C鼠來源的脾細胞Co6030Gy輻照后作為刺激細胞，以移植后10d2組小鼠脾細胞為反應(yīng)細胞，培養(yǎng)3d，3H摻入法檢測H2b脾細胞（反應(yīng)細胞）的增殖效應(yīng)；細胞毒性試驗檢測脾細胞對 H-2d抗原包被的腫瘤細胞CT-26的殺傷作用；CTLL-2細胞增殖實驗檢測脾細胞在H-2d抗原刺激下所表達的IL-2水平。⑤建立小鼠移植物抗白血病模型，實驗分3組：第一組：輸注異基因骨髓細胞及帶luciferaceA20（H-2d）（1×1

7、06）；第二組：HGT/IL-35+輸注異基因骨髓細胞+脾細胞及帶luciferaceA20（H-2d）（1×106）；第三組：HGT/control+輸注異基因骨髓細胞+脾細胞及帶 luciferaceA20（H-2d）（1×106）；每周在小動物活體成像儀上觀察3組小鼠的體內(nèi)腫瘤熒光，每2d給小鼠稱重，觀察小鼠生存，繪制生存曲線。⑥在小鼠急性移植物抗宿主病模型基礎(chǔ)上，實驗分4組：第一組：水流動力學(xué)注射IL-35質(zhì)粒（HGT/IL-3

8、5）；第二組：水流動力學(xué)注射空質(zhì)粒（HGT/control）；第三組：水流動力學(xué)注射IL-35質(zhì)粒（HGT/IL-35），12小時后腹腔注射anti-IL-35抗體400μg，7d后腹腔注射 anti-IL-35抗體200μg；第三組：水流動力學(xué)注射 IL-35質(zhì)粒（HGT/IL-35），12小時后腹腔注射IgG control抗體400μg，7d后腹腔注射IgG control抗體200μg；移植后觀察小鼠aGVHD表現(xiàn)，每2d給小鼠

9、稱重，觀察小鼠生存，繪制生存曲線。
　　結(jié)果：①HGT/IL-35小鼠免疫組化在肝臟檢測到IL-35的高效表達，HGT/control組小鼠出現(xiàn)中到重度的aGVHD表現(xiàn)，HGT/IL-35組小鼠GVHD程度輕，HGT/control組小鼠出現(xiàn)明顯的肺部、肝臟和腸道病理改變。兩組小鼠生存有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.0001）。②HGT/IL-35組小鼠B、Mφ、DC、Neu細胞比例及數(shù)量與HGT/control組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<

10、0.05）；HGT/IL-35組小鼠脾CD4+效應(yīng)T細胞比例下降，與HGT/control組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；HGT/IL-35組小鼠CD3、CD4細胞比例高于HGT/control組（P<0.05）。③HGT/IL-35組小鼠脾、肝、肺、小腸CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ較HGT/control組明顯下降（P<0.05）；脾、肺CD4+T淋巴細胞分泌TNF-α較HGT/control組明顯下降（P<0.05）；肝、小

11、腸CD4+T淋巴細胞分泌IL-17比例較 HGT/control組明顯下降（P<0.05）；肺 CD4+T淋巴細胞分泌 IL-17比例較HGT/control組明顯升高（P<0.05）；HGT/IL-35組小鼠脾、肝、肺、小腸 CD4+T淋巴細胞分泌 IL-10較 HGT/control組明顯上升（P<0.05）。HGT/IL-35組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6含量較HGT/control組下降（P<0.05），而IL-1

12、0含量有明顯上升（P<0.05）。IL-17血清濃度2組無統(tǒng)計學(xué)差異。④小鼠肺、肝、小腸 CD4+FoxP3+T細胞比例 HGT/IL-35組與 HGT/control組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；脾、肺、肝CD8+FoxP3+T細胞比例HGT/IL-35組與HGT/control組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；肝、小腸CD4+BrdU+細胞比例HGT/IL-35組明顯低于HGT/control組（P<0.05）；而CD8+B

13、rdU+細胞比例二組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；肝、肺CD4+FoxP3+BrdU+T細胞比例HGT/IL-35組明顯高于HGT/control組（P<0.05）；脾、肺CD8+FoxP3+BrdU+T細胞比例HGT/IL-35組明顯高于HGT/control組（P<0.05）；⑤3H嵌入、細胞毒性實驗、及 IL-2水平的檢測結(jié)果二組間有顯著性差異（P<0.05）。⑥IL-35組小鼠在降低GVHD的同時并沒有削弱GVL效應(yīng)。

14、　　⑦應(yīng)用anti-IL-35抗體能阻斷IL-35的免疫抑制作用，四組小鼠生存有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：IL-35能明顯抑制GVHD的病理進程、明顯改善生存率。其機制主要是通過抑制B、Mφ、DC、Neu細胞比例及數(shù)量，抑制CD4+T細胞分泌IFN-γ、TNF-α，抑制肝、小腸CD4+T細胞分泌IL-17，促進肺CD4+T細胞分泌IL-17，促進脾、肺、肝、小腸分泌IL-10，抑制CD4+T細胞增殖，促進Treg擴增

15、等共同發(fā)揮作用，并且IL-35在抑制GVHD的同時并沒有削弱GVL效應(yīng)。
　　三、Treg和Th17相關(guān)細胞因子在移植物抗宿主病中的作用研究
　　目的：研究Treg細胞、Th17細胞及相關(guān)細胞因子在臨床移植物抗宿主病患者中的作用。
　　方法：2010年8月至2011年9月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科接受異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）的76例患者中，男性46例、女性30例，中位年齡34（11～57）歲。實施同

16、胞全相合異基因移植（allo-HSCT）患者44例，無關(guān)供者全相合外周血干細胞移植（MUD-PBSCT）22例，單倍型骨髓移植（HID-BMT）7例，臍血移植3例。流式細胞術(shù)檢測GVHD發(fā)生時GVHD改善后外周血Treg細胞、Th17細胞比例，應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測Th17相關(guān)細胞因子，應(yīng)用ELISA檢測血漿中IL-17、IL-23含量，分析與GVHD相關(guān)性。
　　結(jié)果：所有患者均獲造血重建，其中45(59.2%)

17、例患者發(fā)生 aGVHD，7(9.2%)例為cGVHD患者，45例aGVHD患者中，I°aGVHD12(26.7%)例；II°aGVHD16(35.5%)例；III°aGVHD5(11.1%)例；IV°aGVHD12(26.7%)例；aGVHD發(fā)生的中位時間為32(15-94)d。aGVHD（II°-IV°）患者Th17細胞比例及RORγt基因表達量明顯高于 aGVHD（0°- I°）患者及正常對照組。而 Treg細胞比例及 FoxP3基

18、因表達量aGVHD（II°-IV°）患者明顯低于aGVHD（0°-I°）患者及正常對照組。cGVHD患者FoxP3基因表達量低于正常對照組。aGVHD（II°-IV°）患者IL-6, IL-1β, IL-17, IL-21, IL-23和IL-23R基因表達量明顯高于aGVHD（0°-I°）患者，而IL-22基因的檢測結(jié)果則相反，aGVHD（II°-IV°）患者低于aGVHD（0°-I°）患者，cGVHD患者中IL-1β和 IL-23明