吲哚胺2,3-加氧酶在異基因造血干細(xì)胞移植后急性移植物抗宿主病中的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、第一部分異基因造血干細(xì)胞后病人血漿IDO活性與aGVHD的相關(guān)性研究
　　【目的】研究IDO和IFNγ在異基因造血干細(xì)胞移植后病人中的表達(dá)情況,了解IDO活性與aGVHD的嚴(yán)重程度及IFN的關(guān)系,探討IDO的活性檢測在診斷aGHVD及aGHVD分級中的作用
　　【方法】逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測89例異基因造血干細(xì)胞患者和8個正常人單個核細(xì)胞中IDOmRNA的表達(dá)情況;反相高效液相色譜法檢測血漿中IDO的活性;ELISA檢測IFNγ

2、的水平。
　　【結(jié)果】在74個有aGVHD的患者中55個(74.32％)檢測到IDOmRNA的表達(dá),在26個無aGVHD患者僅有2個檢測到IDOmRNA的表達(dá),8個健康人中未檢測到IDO表達(dá);血漿IDO的活性在aGVHD病人遠(yuǎn)高于無aGVHD病人(4.74±3.35vs1.79±1.02;P<0.0001)或者健康人(4.74±3.35vs1.77±0.22;P<0.0001),重度aGVHD(III/IV級)患者IDO活性高于輕

3、度aGVHD(I/II級)患者(6.57±3.34vs2.46±1.41;P<0.0001).同時,在aGVHD病人血漿IFNγ的水平也是增高的(P=0.0043);aGVHD緩解后IDO的活性下降,當(dāng)aGVHD復(fù)發(fā)時,IDO的活性又會升高;血漿IDO的活性與IFN的水平相關(guān)(r=0.8288;P<0.0001),利用ROC曲線分析,IDO活性的曲線下面積高于IFNγ(0.852vs0.694),IDO的靈敏度和特異度分別是81%和78

4、%,而IFNγ的靈敏度和特異度分別是41%和93%。
　　【結(jié)論】aGVHD病人外周血單個核細(xì)胞有IDOmRNA表達(dá);血漿IDO的活性增高在aGVHD病人且與aGVHD的嚴(yán)重程度相關(guān);結(jié)合血漿IFN水平,IDO活性可能作為診斷和評估異基因造血干細(xì)胞移植后aGVHD的生物標(biāo)志;干預(yù)IDO途徑可能是一個可用的方法去治療激素?zé)o效的aGVHD。
　　第二部分IDO在小鼠急性移植物抗宿主病靶器官的表達(dá)研究
　　【目的】檢測吲哚胺

5、2,3加氧酶(IDO)在aGVHD小鼠各組織器官的表達(dá)情況,探究IDO與aGVHD靶器官損傷的關(guān)系,為調(diào)節(jié)色氨酸代謝途徑抑制aGVHD反應(yīng)甚至誘導(dǎo)免疫耐受做初步探索。
　　【方法】以BALB/c(H-2b)雌性小鼠為受者,接受致死劑量的γ射線(8.0Gy)全身照射后,輸注雄性C57BL/6(H-2d)供鼠的骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞,同時設(shè)立同基因移植對照組,觀察受鼠的體征和存活時間,進(jìn)行aGVHD臨床評分,aGVHD評分≧7時,處死小鼠,

6、應(yīng)用反相高效液相色譜法(HPLC)檢測血漿中色氨酸(Trp)和其代謝產(chǎn)物犬尿氨酸(Kyn)的濃度,以及IDO的活性,用RT-PCR和免疫組化方法檢測各組織中IDOmRNA與蛋白的表達(dá)水平,流式細(xì)胞學(xué)檢測外周血CD4+/CD25+Treg細(xì)胞比例。
　　【結(jié)果】異基因移植組小鼠血漿中Trp濃度明顯低于同基因移植小鼠(P<0.05),而Kyn濃度高于對照小鼠(P<0.05),IDO活性明顯較對照組高(P<0.01)。結(jié)腸和肺IDOmR

7、NA表達(dá)水平高于對照小鼠(P<0.01),兩組小鼠小腸IDO表達(dá)水平很低對比無明顯差異,皮膚和肝臟IDOmRNA表達(dá)不明顯。免疫組化結(jié)果顯示:aGVHD小鼠肺臟和結(jié)腸上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)IDO;小腸組織IDO的表達(dá)差別不明顯;皮膚血管內(nèi)皮細(xì)胞檢測到IDO的表達(dá)且組織中散在IDO陽性單個核細(xì)胞;肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IDO,且匯管區(qū)周圍散在分布IDO陽性的單個核細(xì)胞;對照小鼠各組織IDO的表達(dá)低或不表達(dá)。
　　【結(jié)論】IDO的

8、表達(dá)在aGVHD靶器官組織水平的免疫調(diào)節(jié)中有重要作用,血管內(nèi)皮細(xì)胞作為最先接觸到異體反應(yīng)T細(xì)胞的受體細(xì)胞,參與了這一作用;調(diào)節(jié)色氨酸代謝途徑可能是治療aGVHD一個有效對策。
　　第三部分色氨酸代謝產(chǎn)物類似物3,4-DAA通過抑制Th1細(xì)胞反應(yīng)緩解aGVHD
　　【目的】通過吲哚胺2,3加氧酶(IDO)代謝局部色氨酸被認(rèn)為是調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫的一個重要機(jī)制。3,4-DAA是一個人工合成的有活性的鄰氨基苯甲酸酸衍生物,已經(jīng)被證實(shí)對

9、治療Th1介導(dǎo)的自身免疫性疾病例如多發(fā)性硬化是有效的。我們的目的是研究3,4-DAA在治療aGVHD的效果及它可能的作用機(jī)制
　　【方法】構(gòu)建一個小鼠的aGVHD模型,在骨髓移植后立即或aGVHD啟動時,腹腔注射3,4-DAA,每只小鼠200mg/kg/day,連續(xù)用14天;定期記錄aGVHD的表現(xiàn)和小鼠的存活情況;HE染色評估靶器官的病理損傷;反相高效液相色譜法和Elisa檢測血漿中IDO的活性及細(xì)胞因子的水平。
　　【結(jié)

10、果】骨髓移植后給藥3,4-DAA明顯的降低aGVHD的嚴(yán)重程度和組織學(xué)評分;與對照組相比,給予3,4-DAA預(yù)防和治療組小鼠的生存期延長,在3,4-DAA治療組小鼠,血漿IFNγ和IL-2的水平下降,而IDO的活性劑IL-10的水平提高。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)一致,在體外,3,4-DAA也能夠抑制脾臟T淋巴細(xì)胞分泌IFNγ和IL-2。
　　【結(jié)論】3,4-DAA能夠減輕小鼠實(shí)驗(yàn)性aGVHD通過調(diào)節(jié)輔助T淋巴細(xì)胞分化,這一特性使它成為一個可能備

11、選的藥物來用于臨床預(yù)防和治療GVHD。
　　第四部分干擾素-γ體外誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞IDO表達(dá)及其免疫抑制作用的初步研究
　　【目的】探討干擾素-γ(IFNγ)誘導(dǎo)小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)的表達(dá)情況,及體外對T細(xì)胞增殖的影響。
　　【方法】組織塊貼壁法培養(yǎng)小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)行形態(tài)特征觀察,并進(jìn)行系列鑒定,經(jīng)過傳代純化后,分別用不同濃度的IFNγ誘導(dǎo)作用微血管內(nèi)皮細(xì)胞,Westernb

12、lot和RT-PCR分別測定未經(jīng)處理的內(nèi)皮細(xì)胞以及IFNγ和或VP-16處理后內(nèi)皮細(xì)胞IDO基因及蛋白表達(dá)水平。反相高效液相色譜法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中色氨酸、犬尿氨酸的水平,從而檢測IDO活性的水平。在體外將肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞與小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),T淋巴細(xì)胞用羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記,流式細(xì)胞儀測定T細(xì)胞的增殖情況,
　　【結(jié)果】獲得的內(nèi)皮細(xì)胞具有規(guī)律的鵝卵石樣形態(tài),CD31相關(guān)抗原間接免疫熒光染色陽性而且

13、在透射電鏡觀察到Weilel—palade小體。IFNγ處理后的微血管內(nèi)皮細(xì)胞IDOmRNA及蛋白表達(dá)增高,IDO活性水平隨IFNγ的濃度的增大逐漸提高。VP-16作用后,在IFNγ刺激下,肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IDO的能力減低,無IFNγ刺激,微血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)IDO。IFNγ處理后的微血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠抑制T細(xì)胞的增殖(P<0.05),而未處理的內(nèi)皮細(xì)胞對T細(xì)胞的增殖抑制作用不顯著。
　　結(jié)論:IFNγ能夠通過誘導(dǎo)IDO的表達(dá)增