TLR4信號(hào)通路與日本血吸蟲感染所致肝纖維化的關(guān)系及其機(jī)制初步研究.pdf

1、研究背景與目的：肝纖維化(hepatic fibrosis)繼發(fā)于多種慢性肝病,是肝損傷后的組織自我修復(fù)過(guò)程中的代償性反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是肝臟慢性炎癥過(guò)程中肝內(nèi)膠原纖維的生成與降解失衡，致使膠原沉積過(guò)多而引起的病理過(guò)程，是多種慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化（hepatic cirrhosis）的必經(jīng)階段。已有研究發(fā)現(xiàn)炎癥和氧化應(yīng)激損傷是肝纖維化發(fā)生的直接因素。Toll樣受體（TLRs)作為一種模式識(shí)別受體在抗感染以及炎癥反應(yīng)中起重要作用。已有研究發(fā)

2、現(xiàn)TLR4在酒精性肝纖維化、病毒性肝纖維化以及原發(fā)性膽汁性肝纖維化中起重要作用，但還沒(méi)有研究報(bào)道TLR4在日本血吸蟲感染所致的肝纖維化中的作用，其機(jī)制也不明確。本文旨在研究TLR4在日本血吸蟲感染所致肝纖維化中的作用，并初步探討其機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和日本血吸蟲感染所致肝纖維化動(dòng)物模型的建立
　?。?）健康SPF級(jí)雌性6-8周齡BALB/c小鼠50只，隨機(jī)分為未感染正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。其中，隨機(jī)選取

3、40只小鼠作為實(shí)驗(yàn)組，取20±3條日本血吸蟲尾蚴采用腹部皮膚貼片法感染小鼠，分別于感染后第5、6、8和12周各剖殺10只。剩余10只小鼠作為正常對(duì)照組，同實(shí)驗(yàn)組于第8周同時(shí)間剖殺。
　?。?）健康SPF級(jí)雌性6-8周齡BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為無(wú)感染無(wú)用藥正常對(duì)照組（n=10）和實(shí)驗(yàn)組（n=30）。實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取20只，取20±3條日本血吸蟲尾蚴采用腹部皮膚貼片法感染小鼠后隨機(jī)分為兩組（每組10只小鼠），其中一組小鼠于感染4

4、w后經(jīng)腹部注射TLR4抑制劑瑞沙托維TAK-242(Resatorvid，簡(jiǎn)稱TAK)，2次/周，0.3mg/kg體重，持續(xù)到第8周；同時(shí)設(shè)立未感染TAK治療組（n=10）。以上各組均于第8周剖殺。
　　2.動(dòng)物標(biāo)本的處理：收集正常對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟組織，分別用于總RNA提取、蛋白的提取以及石蠟切片的制備。
　　3.實(shí)驗(yàn)方法
　?。?）Masson染色法檢測(cè)肝纖維化程度：Masson染色法用于觀察和檢測(cè)日本血吸

5、蟲感染后小鼠肝臟的病理改變及纖維化程度，其原理是利用陰離子染料分子大小和組織不同的滲透性來(lái)完成染色的。一般說(shuō)來(lái)，結(jié)構(gòu)稀疏，滲透性高的組織多選擇大分子染料，而結(jié)構(gòu)致密，滲透性低的組織多選擇小分子染料。所以，膠原纖維被大分子的陰離子染料著染，肌纖維和胞質(zhì)被中等大小的陰離子染料著染，而紅細(xì)胞則被最小分子的陰離子染料所著染。染色的結(jié)果是：膠原纖維成藍(lán)色（用苯胺藍(lán)復(fù)染）或綠色（用亮綠復(fù)染），胞質(zhì)、肌纖維和紅細(xì)胞紅色，胞核藍(lán)褐色。
　?。?）

6、轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè):采用熒光定量PCR檢測(cè)日本血吸蟲感染后第5、6、8和12周和應(yīng)用TLR4抑制劑 TAK治療前后小鼠肝臟組織內(nèi)肝纖維化的指標(biāo)包括α-SMA、Ⅰ型膠原（CollangenⅠ,colα-1）和Ⅲ型膠原（CollagenⅢ,colα-3）的RNA表達(dá)水平，肝纖維化過(guò)程中TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的TLR4，接頭蛋白MyD88、TRIF和炎癥性細(xì)胞因子 TNF-α、pro-IL-1β以及IP-10、RANTES的轉(zhuǎn)錄水平,炎癥小體內(nèi)的識(shí)

7、別受體NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM-2和pro-Caspase-1的mRNA表達(dá)水平。
　?。?）蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)日本血吸蟲感染后第5、6、8和12周和應(yīng)用TLR4抑制劑TAK治療后的小鼠肝臟組織內(nèi)α–SMA的蛋白表達(dá)水平，以及肝纖維化過(guò)程中TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中TLR4、p-IRF-3、p-IRAK4、活化的Casepase-1以及IL-1β的蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：

8、　?。?）小鼠肝臟的膠原面積在日本血吸蟲感染后的第5、6、8、12周逐漸增大，I型、III型膠原的轉(zhuǎn)錄水平以及肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志分子α-SMA的表達(dá)水平逐漸升高，第8周最嚴(yán)重；相較于第8周，第12周膠原面積變小，I型和III型膠原轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平也降低，同時(shí)α-SMA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均降低。
　　（2）相較于未感染組，感染后5、6、8和12周小鼠肝組織內(nèi)天然免疫模式識(shí)別受體TLR4，接頭分子MyD88、TRIF以及炎癥性細(xì)胞因子T

9、NF-α、IL-1β以及IP-10、RANTES轉(zhuǎn)錄水平均增加，TLR4，p-IRAK4、p-IRF3主要表達(dá)在肝臟門脈系統(tǒng)周圍細(xì)胞及蟲卵肉芽腫&纖維組織附近的肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞內(nèi)。
　?。?）TLR4抑制劑 TAK處理后，小鼠肝臟膠原面積在日本血吸蟲感染后的第8周顯著減少，α-SMA、I型和III型膠原的陽(yáng)性表達(dá)降低。
　　（4）TLR4抑制劑TAK處理后，肝臟TNF-α、pro-IL-1β和IP-10、R

10、ANTES轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平下降，肝臟p-IRAK4、p-IRF3蛋白表達(dá)水平下降。
　?。?）日本血吸蟲感染后5、6、8、12周小鼠肝臟炎癥小體內(nèi)的受體包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、AIM-2以及pro-Caspase-1、pro-IL-1β mRNA水平增多，同時(shí)活性Caspase-1（p10）和IL-1β（p17）蛋白表達(dá)水平也升高；TLR4抑制劑TAK治療后，肝臟NLRP1、NLRC4、AIM-2、pro-Caspas

11、e-1和pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平下降；肝臟內(nèi)活性Caspase-1(p10)和IL-1β(p17)的表達(dá)水平也下調(diào)。
　　結(jié)論：
　?。?）小鼠肝臟于日本血吸蟲感染后的第5周出現(xiàn)少量的纖維化，隨后纖維化逐漸加重，到第8周時(shí)纖維化最嚴(yán)重，感染后的第12周進(jìn)入慢性肝纖維化期，肝纖維化程度與TLR4-MyD88依賴的信號(hào)通路和MyD88非依賴（TRIF依賴）信號(hào)通路的活化呈正相關(guān)。
　?。?）日本血吸蟲感染所致肝纖維化過(guò)