人可溶性CD83基因的克隆、原核表達(dá)、純化及其融合蛋白活性檢測.pdf

1、CD83分子是一個(gè)分子量約為40-45kDa大小的糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族成員[1,2]，其功能還不是完全清楚。CD83分子表達(dá)在成熟樹突狀細(xì)胞和活化的淋巴細(xì)胞表面具有激活免疫效應(yīng)細(xì)胞功能[1-5]?？扇苄问紺D83分子（sCD83）已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在正常人血清中[6-8]，但是其產(chǎn)生的機(jī)制還不是完全清楚。有研究表明sCD83是由膜表面的的CD83分子脫落產(chǎn)生的[8]，最新研究表明sCD83也可以從CD83基因轉(zhuǎn)錄體選擇剪接產(chǎn)生[9]。同

2、時(shí)重組的sCD83蛋白具有強(qiáng)大的抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）和樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）介導(dǎo)的同種異體T細(xì)胞增殖反應(yīng)作用[10]。在sCD83對(duì)C57Bl/6小鼠自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型體內(nèi)作用研究時(shí)，sCD83可以預(yù)防和治療EAE的癱瘓癥狀，說明sCD83具有免疫抑制作用[11]。為了解sCD83功能及作用方式，表達(dá)并得到其高純度融合蛋白是非常重要的，所以，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)表達(dá)含有6個(gè)His標(biāo)簽的融合蛋白

3、6×His-sCD83，用Ni-NTA親和層析純化，并且檢測融合蛋白體外活性。
　　方法：利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法從正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中獲得可溶性CD83基因，克隆到表達(dá)載體pET-32a載體，構(gòu)成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6×His融合蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE及Western blot檢測和鑒定。表達(dá)產(chǎn)物包涵體經(jīng)Ni-NTA親和層析純化。用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測融合蛋白體外活性

4、。
　　結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及測序證實(shí)可溶性CD83蛋白基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建正確。經(jīng)SDS-PAGE及Western blot顯示在相對(duì)分子質(zhì)量約32000處出現(xiàn)融合表達(dá)條帶。融合蛋白的表達(dá)量約占菌體蛋白總量的45％。重組蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化后，得到了高純度的融合蛋白?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明融合蛋白具有體外活性。
　　結(jié)論：成功克隆人外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的可溶性CD83基因片段，并在大腸桿菌BL21（DE3