可溶性CD40L促進(jìn)宮頸癌患者DC分化成熟及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究可溶性CD40配體(solubleCD40ligand，sCD40L)對(duì)宮頸癌患者DC分化、成熟及其免疫活性的影響，并探討其作用機(jī)制，為sCD40L應(yīng)用于臨床宮頸癌綜合治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.采用密度梯度離心法分離出宮頸癌患者單個(gè)核細(xì)胞(MNC)，用含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)2h后，去除非貼壁細(xì)胞，收集貼壁的細(xì)胞。將得到的貼壁細(xì)胞加入細(xì)胞因子GM-CSF（20ng/ml）和

2、IL-4(20ng/ml)進(jìn)行DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)，隔日半量換液并補(bǔ)加細(xì)胞因子，培養(yǎng)5d后，將細(xì)胞分為三組:對(duì)照組只加入GM-CSF和IL-4;TNF-α組加入TNF-α(10ng/ml)、GM-CSF和口IL-4;sCD40L組加GM-CSF、IL-4及sCD40L（20ng/ml）。各組均培養(yǎng)至8d后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.采用FCM檢測(cè)各組DC表面CD80、CD86、CD83、CD1a、MHC(I)及MHC(II)的表

3、達(dá)百分率。
　　 3.采用RT-PCR技術(shù)半定量檢測(cè)各組DC表達(dá)IFN-γ、IL-12、IL-10及TGF-β1mRNA的水平。并用ELISA技術(shù)檢測(cè)各組培養(yǎng)體系中IFN-γ、IL-12、IL-10及TGF-β1的含量。
　　 4.采用Westernblot和RT-PCR技術(shù)分別從蛋白和基因水平檢測(cè)sCD40L對(duì)樹突狀細(xì)胞信號(hào)通路蛋白MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3表達(dá)水平的影響。
　　 5.采用M

4、TT法通過混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測(cè)不同組DC刺激異基因T細(xì)胞增殖能力。
　　 6.采用ELISA技術(shù)分別檢測(cè)各組MLR體系中IFN-γ和IL-4的含量。
　　 7.采用MTT法檢測(cè)各組DC誘導(dǎo)負(fù)載凍融抗原細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)Hela細(xì)胞株的殺傷活性。
　　 結(jié)果:
　　 1.在誘導(dǎo)宮頸癌患者M(jìn)NC分化為DC的過程中，不同組的DC均發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化。sCD40L及TNF-α誘導(dǎo)組DC不僅細(xì)胞

5、數(shù)量較對(duì)照組細(xì)胞數(shù)明顯增多，且成簇分布，增大的胞體表面?zhèn)巫銧钔黄鸶鼮槊黠@。
　　 2.sCD40L誘導(dǎo)組DC表達(dá)CD80、CD86、MHC(I)、MHC(II)及CD1a的水平明顯高于對(duì)照組DC(P＜0.05)。與TNF-α誘導(dǎo)組相比，無明顯差異(P＞0.05)。而sCD40L誘導(dǎo)組和TNF-α誘導(dǎo)組DC表達(dá)CD83的水平明顯高于對(duì)照組DC(P＜0.01)。同時(shí)，sCD40L誘導(dǎo)組DC表達(dá)CD83的水平明顯高于TNF-α誘導(dǎo)組。

6、
　　 3.RT-PCR結(jié)果顯示，sCD40L誘導(dǎo)組DC表面表達(dá)IFN-γ和IL-12mRNA的水平明顯高于對(duì)照組DC(P＜0.01);而表達(dá)IL-10及TGF-β1的水平則明顯低于對(duì)照組DC(P＜0.01)。
　　 4.ELISA結(jié)果顯示，sCD40L誘導(dǎo)組、TNF-α誘導(dǎo)組和對(duì)照組DC培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平分別為322.15±72.10、267.79±45.33、185.65±56.22，細(xì)胞因子IL

7、-12的分泌水平分別為133.60±22.17、119.43±15.46、65.89±12.71，細(xì)胞因子IL-10的分泌水平分別為97.81±13.45、101.87±16.35、129.67±23.11，細(xì)胞因子TGF-β1的分泌水平分別為44.67±7.86、42.24±9.98、96.33±14.57。其中sCD40L誘導(dǎo)組培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-12的含量明顯高于TNF-α誘導(dǎo)組及對(duì)照組(P＜0.01);而IL-10及TG

8、F-β1的含量與TNF-α誘導(dǎo)組無明顯差異(P＞0.05)，但明顯低于對(duì)照組DC(P＜0.01)。
　　 5.sCD40L組、TNF-α組、對(duì)照組DC表達(dá)MAPKp38蛋白水平分別是1.24±0.34、0.92±0.27、0.61±0.31。sCD40L組、TNF-α組、對(duì)照組DC表達(dá)P-STAT1蛋白水平分別是1.17±0.37、0.69±0.28、0.37±0.12。sCD40L組、TNF-α組、對(duì)照組DC表達(dá)P-STAT3

9、蛋白水平分別是0.99±0.21、0.79±0.18、0.52±0.29。其中TNF-α組、sCD40L組DC中轉(zhuǎn)錄因子MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3蛋白及mRNA的水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，同時(shí)sCD40L組DC表達(dá)上述三類轉(zhuǎn)錄因子的水平明顯高于TNF-α組(P＜0.05)，結(jié)果提示CD40L對(duì)DC分化成熟的作用，可能是通過激活MAPKp38、P-STAT1和P-STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　 6

10、.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)DC(∶)T細(xì)胞為1∶80時(shí)，sCD40L組DC刺激T細(xì)胞增殖的OD值明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），但與TNF-α組無明顯差異(P＞0.05)。但當(dāng)DC(∶)T細(xì)胞分別為1∶10和1∶40時(shí)，sCD40L組DC刺激T細(xì)胞增殖的OD值不僅明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，也明顯高于TNF-α組(P＜0.05)。
　　 7.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sCD40L組及TNF-α組MLR體系中IFN-γ的含量明顯高

11、于對(duì)照組(P＜0.01)，同時(shí)sCD40L組MLR體系中IFN-γ的含量明顯高于TNF-α組(P＜0.05);而sCD40L組及TNF-僅組MLR體系中IL-4的含量則明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，而sCD40L組及TNF-α組MLR體系中IL-4的含量，無明顯差異(P＞0.05)。
　　 8.MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)E∶T分別為10∶1及20∶1時(shí)，CD40L組及TNF-α組CTL對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性均明顯高于對(duì)照(P＜

12、0.01)，CD40L與TNF-α組相比，殺傷率雖有增高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但當(dāng)E(∶)T為50∶1時(shí)，sCD40L組及TNF-α組CTL對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，同時(shí)，sCD40L組CTL對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性明顯高于TNF-α組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CD40L可促進(jìn)DC成熟，并上調(diào)DC表面CD80、CD86、MHC(I)及MHC(II)、C

13、D1a及CD83分子表達(dá)。
　　 2.經(jīng)CD40L刺激后，能夠明顯上調(diào)DC分泌IFN-γ、IL-12的水平，下調(diào)DC分泌IL-10、TGF-β1的水平。其機(jī)制可能與影響MAPKp38、P-STAT1、P-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。
　　 3.sCD40L可明顯提高DC誘導(dǎo)同種異體T淋巴細(xì)胞增殖的功能，促進(jìn)DC誘導(dǎo)下，T細(xì)胞分泌IFN-γ，抑制其分泌IL-4。
　　 4.經(jīng)sCD40L刺激后的凍融抗原致敏DC可明