BKCa表達調節(jié)對前列腺癌生長和轉移的影響及其分子機制.pdf

1、前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤。2012年全世界前列腺癌新確診病例110萬，位居各瘤種第二位。在發(fā)達國家前列腺癌新發(fā)病例位居各瘤種首位，在發(fā)展中國家位居第4位。隨著中國經濟的發(fā)展、人口老齡化和人們生活方式的改變，前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前，前列腺癌篩查、早期診斷、手術、放療、化療、內分泌和免疫治療等綜合診療模式使患者的死亡率逐漸降低，但仍有相當一部分患者會出現復發(fā)和轉移。因此，需要不斷探索前列腺癌復發(fā)和轉移的分子機制，尋找潛在的干

2、預靶點。近年來研究發(fā)現，離子通道在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。臨床上大約有13％的藥物都作用于離子通道，用于治療心血管和神經系統異常等多種疾病。因此，探索將離子通道作為某些腫瘤治療的潛在靶點或預測指標具有重要的研究意義。
　　BKCa是廣泛表達于心肌、血管平滑肌、神經系統等全身多種組織和器官的大電導鈣激活鉀通道。BKCa在可興奮細胞中主要通過調節(jié)細胞膜電位和細胞內鈣信號，參與調控血管舒縮性和神經興奮性等生理功能。近年來研究

3、發(fā)現，BKCa在多種腫瘤中呈高表達并參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等許多惡性生物學行為。BKCa的編碼基因在晚期前列腺癌中的擴增率達16%，而在早期患者中無擴增。目前研究發(fā)現，BKCa可以促進前列腺癌的增殖，但其分子機制尚未完全闡明。此外，除細胞增殖外BKCa是否也參與了前列腺癌的轉移、BKCa在體外的促腫瘤作用是否也能在體內實現這些問題均有待回答。本課題從前列腺癌細胞系、荷瘤裸鼠體內和臨床腫瘤組織和三個層面檢測了BKCa的表達

4、和功能，初步探討了BKCa表達調節(jié)對前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲、體內成瘤和轉移的影響及其分子機制。
　　第一部分 BKCa在前列腺癌細胞和組織中的表達
　　目的：比較 BKCa在前列腺癌細胞和組織與正常細胞和癌旁良性組織中的表達差異，分析BKCa表達與前列腺癌臨床分期和腫瘤增殖標志物Ki67的相關性。
　　方法：采用實時熒光定量PCR、Western blot和細胞免疫熒光檢測BKCa在前列腺癌細胞PC3和C4-2和

5、正常前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達。采用實時熒光定量PCR、Western blot和免疫組織化學法檢測了前列腺癌組織與癌旁良性組織中BKCa的表達差異。采用免疫組織化學法檢測了前列腺癌組織中 BKCa的表達與腫瘤分期和Ki67表達的相關性。
　　結果：定量PCR和Western blot結果顯示BKCa的mRNA和蛋白質在前列腺癌組織和細胞系中的表達均高于癌旁良性組織和正常前列腺上皮細胞系。免疫組化結果提示，BKCa在前列腺

6、癌組織中的表達與增殖標志物 Ki67呈正相關，且BKCa的表達隨著前列腺癌分期的提高而增加，IV期前列腺癌中BKCa的表達明顯高于I-III期。
　　結論：BKCa在前列腺癌組織和細胞中的表達明顯高于癌旁良性組織和正常上皮細胞，前列腺癌組織中BKCa與Ki67的表達呈正相關，且腫瘤分期越晚BKCa表達越高。
　　第二部分 BKCa表達調節(jié)對前列腺癌生長和轉移的影響
　　目的：探討B(tài)KCa表達調節(jié)對前列腺癌生長和轉移的影

7、響
　　方法：通過質粒載體介導的 BKCa上調體系和慢病毒載體介導的 BKCa穩(wěn)定沉默體系實現對前列腺癌PC3和C4-2細胞系中BKCa表達的上、下調，并采用MTT、EdU、平板克隆、細胞劃痕、Transwell遷移和侵襲實驗檢測 BKCa表達上、下調對細胞增殖、遷移和侵襲的影響。采用前列腺癌PC3細胞構建裸鼠皮下種植瘤模型和細胞尾靜脈注射肺轉移模型，檢測 BKCa表達下調對腫瘤生長和轉移的影響及腫瘤組織中Ki67的表達變化。

8、r>　　結果：BKCa表達上調后，前列腺癌細胞的細胞活力、DNA合成效率和克隆形成能力較對照組明顯提高，細胞劃痕愈合率、遷移和侵襲的細胞數量也較對照組顯著提高；BKCa表達下調則會抑制前列腺癌細胞的上述生物學行為。體內研究顯示，BKCa表達下調后PC3細胞裸鼠種植瘤體積、質量和Ki67表達較對照組明顯降低，尾靜脈注射的PC3細胞肺臟轉移數目明顯減少。
　　結論： BKCa表達上調可促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力；BKCa表

9、達下調則會抑制前列腺癌細胞的上述生物學行為，并抑制腫瘤在裸鼠體內生長和轉移。
　　第三部分 BKCa調控前列腺癌生長和轉移的分子機制
　　目的：探討B(tài)KCa調控前列腺癌生長和轉移的分子機制
　　方法：采用膜片鉗技術驗證BKCa激動劑NS1619和抑制劑IBTX對PC3細胞鉀電流的作用，并檢測 BKCa活性調節(jié)對前列腺癌增殖和遷移的影響。采用激光共聚焦免疫熒光和免疫共沉淀技術檢測BKCa與整合素αvβ3和FAK的共定位和

10、相互作用情況，通過Western blot檢測BKCa表達調節(jié)對整合素αvβ3、FAK和p-FAK（Tyr397）表達的影響。采用整合素αvβ3封閉抗體LM609和FAK抑制劑Y15處理BKCa表達上調的 PC3細胞，檢測細胞增殖和遷移變化，驗證整合素αvβ3/FAK通路在BKCa調節(jié)前列腺癌細胞增殖和遷移中發(fā)揮的作用。采用免疫熒光技術檢測臨床前列腺癌標本中的BKCa和p-FAK（Tyr397）表達的相關性。
　　結果：BKCa的

11、離子通透功能在促進前列腺癌細胞增殖和遷移中發(fā)揮一定作用但并非主要機制。BKCa與整合素αvβ3和FAK存在共定位和相互作用，BKCa表達調節(jié)對整合素αvβ3和FAK的表達無影響，但可通過與整合素αvβ3和FAK形成功能復合體，加強后兩者間的信號偶聯從而增加FAK的磷酸化，最終促進PC3細胞的增殖和遷移。阻斷αvβ3/ FAK信號通路后可明顯削弱BKCa表達上調對細胞增殖和遷移的促進作用。在臨床前列腺癌標本中，BKCa和p-FAK（Tyr