大鼠肌源性干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及分離方法的比較.pdf

1、目的：
　　通過不同的方法分離肌源性干細(xì)胞、然后對(duì)其培養(yǎng)、鑒定,并比較肌源性干細(xì)胞表面抗原Sca-1的陽性率,尋找分離肌源性干細(xì)胞的理想方法,為下一步進(jìn)行生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染的肌源性干細(xì)胞注射治療壓力性尿失禁的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　根據(jù)消化酶添加的順序及消化時(shí)間的不同,本實(shí)驗(yàn)采用常見的4種消化分離法從4-6周齡SD大鼠大腿分離肌源性干細(xì)胞,差速貼壁法純化,通過流式細(xì)胞儀、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定,并比較不同方

2、法獲得的肌源性干細(xì)胞Sca-1的陽性率。
　　此4種消化分離方法是:
　　1、方法一:將適量骨骼肌組織碎塊一次性放入Ⅰ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶、DispaseII及胰酶的混合酶中消化;
　　2、方法二:將適量骨骼肌組織碎塊首先放入Ⅰ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶的混合酶中消化,再用DispaseII和胰酶的混合酶消化;
　　3、方法三:將適量骨骼肌組織碎塊放入Ⅰ型膠原酶和Ⅳ型膠原酶的混合酶中消化,然后用DispaseII、胰酶

3、分別消化;
　　4、方法四:將適量骨骼肌組織碎塊按先后順序依次添加Ⅰ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶、DispaseII及胰酶進(jìn)行消化;
　　結(jié)果：
　　不同的方法分離出的肌源性干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀鑒定CD34、CD45及Sca-1抗體的陽性率分別為35.27％、5.24%及58.92%,細(xì)胞免疫熒光desmin抗體陽性;方法一、方法二、方法三及方法四分離培養(yǎng)的肌源性干細(xì)胞Sca-1平均陽性率不同,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000

4、<0.05),分別為46.5%±16.11%、50.95%±13.46%、55.38%±7.19%及71.58%±2.32%;方法一、方法二、方法三分離培養(yǎng)的肌源性干細(xì)胞Sca-1抗體的陽性率明顯低于方法四分離培養(yǎng)的肌源性干細(xì)胞(P=0.000<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　不同的方法消化大鼠骨骼肌均可獲得肌源性干細(xì)胞,但其純度各異;消化酶之間的相互作用影響肌源性干細(xì)胞的純度,單酶分步消化能提高肌源性干細(xì)