新型抗EGFR人源化抗體基因的構(gòu)建和表達.pdf

1、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種跨膜酪氨酸激酶受體，屬于HER受體家族。由三個結(jié)構(gòu)域組成，即胞外配體結(jié)合域，跨膜域和胞內(nèi)酪氨酸激酶域，在與配體結(jié)合后引起受體構(gòu)象改變，從而引起下游一系列信號傳導(dǎo)通路的活化。研究發(fā)現(xiàn)，許多實體瘤細胞膜表面都存在異常大量EGFR，受體的水平與腫瘤的分化程度、惡性程度、腫瘤的侵潤及預(yù)后密切相關(guān)。近年來，靶向EGFR藥物已成為腫瘤治療的新熱點。本

2、文通過計算機模擬，將鼠－人嵌合抗體cetuximab的鼠源可變區(qū)的CDR及FR部分基因突變?yōu)槿嗽葱蛄?，?gòu)建并表達7種抗EGFR人源化抗體。即以cetuximab為模板，設(shè)計合成輕鏈序列和重鏈可變區(qū)序列，拼接成完整的輕鏈和重鏈基因并克隆入pIRES雙表達載體。瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，用ELISA法初步檢測培養(yǎng)上清中人源化抗體的表達水平；擴大轉(zhuǎn)染體系，再用rProtein A柱進行親和層析純化抗體，并進行SDS-PAGE和免疫印記鑒定，ELI

3、SA和免疫印記結(jié)果顯示均可表達相應(yīng)抗體人；抗體在還原SDS-PAGE中表現(xiàn)為相對分子量約為25×103和50×103兩條帶。采用Biacore3000技術(shù)檢測抗體結(jié)合抗原的能力，結(jié)果表明C3抗體與抗原具有良好的結(jié)合能力(親和力為6.13×10-10M)。把表達載體轉(zhuǎn)化至結(jié)直腸癌細胞SW480，用細胞侵襲實驗初步檢測抗體的功能，結(jié)果表明C2和C3抗體對腫瘤細胞生長遷移均具有一定的抑制作用。與國外市場上常見抗EGFR抗體相比，如FDA于20