小鼠KyoT家族的新異構發(fā)現及其對血管內皮細胞的影響.pdf

1、血管生成是多數情況下血管新生的重要方式——從創(chuàng)傷愈合到特定性生理周期(女性月經周期),從多種人類疾病的發(fā)生到腫瘤的生長和轉移,血管生成參與眾多重要生理性和病理性過程。
　　血管生成是由多步驟組成的復雜過程:首先細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)發(fā)生降解,接著血管內皮細胞(Endothelial cells，ECs)從已有血管中出芽,隨后ECs經歷增殖、遷移、分化而形成血管,最后平滑肌細胞被募集至新生的血

2、管上。ECs不僅是構成血管的重要組成部分,更是血管生成過程重要的“執(zhí)行者”。
　　近年來隨著體外血管生成體系的應用、體內基因剔除/敲入小鼠模型的建立,對血管生成機制的研究也不斷深入,發(fā)現多條信號途徑在細胞、分子水平調控血管生成和ECs功能。Notch信號途徑因參與調控ECs的多種功能,決定ECs的命運,而成為備受關注的調控信號。
　　Notch信號途徑是進化中高度保守的、通過細胞與細胞之間直接接觸而激活的信號途徑,參與調控包

3、括細胞增殖、分化、凋亡、命運決定等多種重要過程。當相鄰細胞間Notch配體與其受體接觸時,Notch受體的胞內段(Notch intracellular domain，NIC)就會釋放進入細胞核,與核內DNA結合蛋白——重組信號結合蛋白-J(Recombination signal binding protein-Jκ，RBP-J)結合,從而激活下游基因的轉錄。在缺少NIC的情況下,RBP-J則通過募集多種轉錄共抑制分子而發(fā)揮抑制轉錄的

4、作用。本室前期研究發(fā)現:RBP-J可通過與LIM蛋白KyoT2結合而募集多種轉錄共抑制分子。但是，KyoT是由選擇性拼接形成的分子亞家族,與RBP-J結合的只有KyoT2嗎?是否還有其它KyoT分子能和RBP-J結合?這種結合對Notch信號途徑有什么樣的調控作用?對ECs的功能又有怎樣的影響?
　　基于上述設想,本課題發(fā)現了KyoT另一個剪接變異體KyoT3,深入研究了與RBP-J結合的LIM蛋白家族KyoT3的組織分布與細胞定

5、位,尋找其與RBP-J結合的直接證據,闡明KyoT3對Notch信號途徑的調控作用,探究KyoT家族成員對ECs的功能的影響。主要研究結果如下:
　　1.發(fā)現了KyoT家族的新異構體。
　　首先,通過以小鼠胚胎cDNA文庫為模板,經聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)獲得 KyoT家族另一剪接變異體,KyoT3。KyoT3,其全長為969 bp,編碼包含323個氨基酸的大小為36.26

6、KD的蛋白質。KyoT3的N-端是與KyoT1相同的3個半LIM結構域,在LIM結構域之后為KyoT1所不具備的3個核定位信號(Nuclear localization signals，NLS)和1個出核序列(Nuclear export sequence，NES)。與KyoT2相同的是:KyoT3也擁有由C-端27個氨基酸構成的RBP-J結合基序,這提示KyoT3可能也具有與KyoT2相似的功能。利用位于KyoT3序列上的酶切位點Xh

7、oⅠ,將KyoT3分為前后2段,通過對2段分別擴增后再拼接的方式,在不改變KyoT3序列、不引入新堿基的情況下,成功構建pMD18-T-KyoT3,為進一步研究KyoT3的功能打下基礎。
　　其次,探明了 KyoT3在組織中的分布和細胞內的定位,并確認其在細胞核內的定位依賴于其 NLS。提取小鼠不同組織器官的RNA,經過反轉錄為cDNA之后,采用KyoT3特異性引物,通過PCR的方法研究KyoT3在組織內的分布,發(fā)現KyoT3的m

8、RNA在小鼠脾臟、胸腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸、心臟、大腦、胎盤、肺臟、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺都有表達,說明其組織分布十分廣泛。為明確 KyoT3在細胞內的定位,構建了含 KyoT3全長的pEGFP-C2-KyoT3和pEGFP-N1-KyoT3;僅含NLS的pEGFP-C2-NLS和pEGFP-N1-NLS;不含有NLS的pEGFP-C2-KyoT3N和pEGFP-N1-KyoT3N質粒。Western blot的方法發(fā)現其中C2-

9、KyoT3N的表達量很低后,通過其它5種質粒分別轉染HeLa細胞,而確定了KyoT3主要分布于細胞核內,并且KyoT3在細胞核內的定位是依賴于其3個串聯的NLS實現的。
　　最后,通過免疫共沉淀驗證了KyoT3與RBP-J之間的相互作用,并進一步明確了KyoT3具有抑制RBP-J依賴的轉錄的作用。構建了帶Myc標簽的pCMV-Myc-KyoT3真核表達質粒,通過與帶Flag標簽的pCMV-RBP-J-Flag共轉染HeLa細胞的方

10、式,采用免疫共沉淀實驗,利用不同的抗體檢測,確認了KyoT3和RBP-J之間存在物理相互作用。隨即使用雙熒光報告基因系統,在HeLa細胞和HEK293細胞內證實KyoT3具有抑制RBP-J依賴的轉錄的作用,并且這種作用具有劑量依賴效應。此外,通過將KyoT3與NIC質粒共轉染HeLa細胞,24 h后用實時定量PCR的方法檢測下游基因Hes-1的mRNA水平的方法,結果也表明:共轉染KyoT3和NIC時,KyoT3能顯著抑制NIC激活的H

11、es-1的轉錄。
　　2.闡明KyoT家族成員對血管內皮細胞的影響。
　　首先,成功分離和培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs),在其中檢測到KyoT家族成員KyoT2的表達。為研究在血管生成中KyoT家族成員的作用,在本室建立了HUVECs的分離、培養(yǎng)的方法,并通過其形態(tài)表現為典型的鋪路石樣、表面CD31分子表達平均約為99％、具有形成管腔的能力,

12、對分離、培養(yǎng)的細胞進行了確認。通過PCR的方法檢測HUVECs中KyoT家族成員的表達。結果發(fā)現:在HUVECs中僅KyoT2表達,于是將研究聚焦于KyoT2。
　　其次,發(fā)現轉染 KyoT2能使 HUVECs細胞系(HUVEC Cell line，HUVEC-CL)中管腔形成增多,tip細胞的數目增加,細胞增殖減少。在后續(xù)的實驗中,使用脂質體 LTXPLUS瞬時轉染 EGFP-KyoT2于HUVECs和HUVEC-CL,通過計數

13、綠色細胞總數的方法,發(fā)現:無論在 HUVECs或是HUVEC-CL中,與轉染EGFP的對照組相比,轉染KyoT2后細胞增殖減弱,然而轉染KyoT2卻能使HUVEC-CL中管腔形成增多,tip細胞的數目增加。
　　通過本課題的研究證實:KyoT另一剪接變異體KyoT3的存在,并明確了其在組織中的分布和細胞內的定位,并且 KyoT3在細胞核內的定位是依賴于其3個串聯的NLS的。KyoT3能夠與RBP-J發(fā)生物理上的相互作用,也因此參與

14、了RBP-J介導的Notch信號途徑的調控。KyoT3能夠抑制RBP-J介導的轉錄激活,并且這種抑制作用具有劑量依賴效應。為研究KyoT家族成員在血管生成中的作用,在本室建立了 HUVECs的分離與培養(yǎng)方法,通過該方法能夠獲得純度高、功能好的HUVECs,作為研究ECs的模型。使用PCR的方法,檢測到僅KyoT2在HUVECs內的表達,因此也將研究重心轉移到KyoT2對ECs的功能影響。進一步研究發(fā)現瞬時轉染KyoT2能夠抑制ECs增殖