人類羊膜細胞的生物學特性及其在神經修復和移植免疫調控中的作用.pdf

1、自二十世紀八十年代起，特別是1998年人胚胎干細胞建立以后，人們越來越重視干細胞在治療一些難治性疾病方面的應用，如中樞神經系統(tǒng)(CNS)疾病、心血管疾病和糖尿病。在干細胞移植治療方面，人們已嘗試過胚胎干細胞和成體干細胞(如造血干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞等)治療相關疾病，并取得了一定的療效，但胚胎干細胞和成體干細胞在臨床上應用還面臨很多問題，如安全性、免疫排斥反應、細胞來源有限以及倫理道德等，嚴重阻礙了干細胞在臨床上的應用。

2、r>　　 近年來，人們發(fā)現在哺乳動物羊膜內也存在干細胞，這種干細胞具有多分化潛力，并且有人報道羊膜干細胞的增殖能力要高于骨髓來源的干細胞。羊膜干細胞(amniotic stem cells)的發(fā)現和研究為上述干細胞臨床應用存在的問題提供了一種可行的解決途徑。羊膜干細胞來源于羊膜(Amnion)，也可稱作胎膜，是與發(fā)育中的胎兒聯系緊密的胚胎發(fā)育早期產物，是母體與胎兒間進行物質交換的重要組織。羊膜干細胞主要分布在羊膜的上皮層和基底層，可表

3、達早期干細胞的一些不同標記，如OCT-4，堿性磷酸酶(AKP)，神經細胞特異的膠質纖維相關蛋白(GFAP)，神經元特異性標記(MAP2)以及神經干細胞特異性標記(Nestin)，肝薄壁組織細胞蛋白等，說明既然羊膜形成于胚胎內細胞團發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的干細胞，仍保留多分化潛能。
　　 同時人羊膜干細胞還具有以下一些特點：
　　 1．自身缺乏主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅱ類抗原，如HLA-A，B，C和DR以及B2

4、免疫球蛋白，移植后不會產生免疫原性，同時人羊膜細胞又表達HLA-E、G抗原，使其具有免疫抑制活性。
　　 2．人羊膜細胞來源非常廣泛，不會產生倫理或者道德的問題。
　　 3．不具致瘤性。
　　 人們已做了大量的研究工作證明了人羊膜干細胞治療疾病的潛力：Zhao等人發(fā)現人羊膜干細胞移植入心臟后，分化成心肌樣細胞；Sakuragawa等人報道了羊膜上皮細胞能有效抑制PD大鼠多巴胺能神經細胞的退變，并且使大鼠的疾病行為

5、明顯改善；Hideori-Okawa等將大鼠羊膜上皮細胞作為供體細胞移植到腦缺血模型鼠的海馬中，發(fā)現人羊膜上皮細胞以類似于CA錐體層神經元的方式存活，這一重要結果提示羊膜細胞有轉變?yōu)樯窠洏蛹毎目赡?，并且具有治療缺血性腦損傷的潛能；Sankar等發(fā)現羊膜上皮細胞能部分恢復脊髓損傷；Wei等報道羊膜上皮細胞能使糖尿病鼠的血糖水平恢復正常，羊膜上皮細胞在體內有潛力分化成β胰島細胞，提示羊膜上皮細胞有治療糖尿病的潛力等等。
　　 人們

6、還有利用人羊膜細胞作為基因治療的工程性細胞載體，來治療一些遺傳性疾病，如黏多糖貯積?、?、家族性高固醇血癥遺傳性肝臟疾病等，也取得不錯的效果。
　　 在我國，上海中科院細胞研究所已建立和完善了羊膜干細胞的培養(yǎng)平臺和羊膜細胞基因改造平臺，并在上述基礎之上，開展了羊膜干細胞治療疾病的多項動物研究，包括以帕金森病為代表的神經退行性疾病的治療，以腦缺血為主的腦損傷治療，以脊髓損傷為主的神經再生治療，以耳毛細胞再生為主的神經性耳聾治療以及糖

7、尿病治療等，并取得了初步的成果。目前已完成了羊膜干細胞和轉基因羊膜干細胞治療腦缺血性疾病的臨床前試驗工作，結果表明羊膜干細胞和轉基因羊膜干細胞對腦缺血性疾病具有很好的治療作用。
　　 以上眾多的有關人類羊膜細胞的基礎及動物實驗研究均表明該細胞有廣闊的臨床應用前景，羊膜及其所包含的細胞如果再結合組織工程技術，將能開發(fā)出各種生物產品以滿足臨床各種疾病治療的需求。
　　 本研究著重從羊膜細胞向神經細胞誘導轉化、神經修復以及中樞

8、神經系統(tǒng)內移植免疫等方面進行探討，為臨床上應用羊膜細胞修復神經創(chuàng)傷作前期準備。
　　 第一部分人羊膜上皮細胞與人羊膜間充質細胞體外分離培養(yǎng)及生物學特性的比較
　　 目的：
　　 比較人羊膜上皮細胞(AECs)與人羊膜間充質細胞(AMSCs)體外分離培養(yǎng)方法及兩種細胞的生物學特性。
　　 方法：
　　 采取酶消化法分離人羊膜細胞，利用兩種細胞居于羊膜組織的不同層次及與羊膜基質不同的附著力各自進行分離

9、培養(yǎng)，通過相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，用流式細胞儀檢測細胞表面標志的表達并作比較性分析，同時進行克隆化培養(yǎng)及誘導分化實驗，
　　 自二十世紀八十年代起，特別是1998年人胚胎干細胞建立以后，人們越來越重視干細胞在治療一些難治性疾病方面的應用，如中樞神經系統(tǒng)(CNS)疾病、心血管疾病和糖尿病。在干細胞移植治療方面，人們已嘗試過胚胎干細胞和成體干細胞（如造血干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞等）治療相關疾病，并取得了一定的療效，但胚胎

10、干細胞和成體干細胞在臨床上應用還面臨很多問題，如安全性、免疫排斥反應、細胞來源有限以及倫理道德等，嚴重阻礙了干細胞在臨床上的應用。
　　 近年來，人們發(fā)現在哺乳動物羊膜內也存在干細胞，這種干細胞具有多分化潛力，并且有人報道羊膜干細胞的增殖能力要高于骨髓來源的干細胞。羊膜干細胞(amniotic stem cells)的發(fā)現和研究為上述干細胞臨床應用存在的問題提供了一種可行的解決途徑。羊膜干細胞來源于羊膜(Amnion)，也可稱作

11、胎膜，是與發(fā)育中的胎兒聯系緊密的胚胎發(fā)育早期產物，是母體與胎兒間進行物質交換的重要組織。羊膜干細胞主要分布在羊膜的上皮層和基底層，可表達早期干細胞的一些不同標記，如OCT-4，堿性磷酸酶(AKP)，神經細胞特異的膠質纖維相關蛋白(GFAP)，神經元特異性標記(MAP2)以及神經干細胞特異性標記(Nestin)，肝薄壁組織細胞蛋白等，說明既然羊膜形成于胚胎內細胞團發(fā)育早期，就有可能保留未成熟低分化的干細胞，仍保留多分化潛能。
　　

12、 同時人羊膜干細胞還具有以下一些特點：
　　 1．自身缺乏主要組織相容性復合體Ⅰ、Ⅱ類抗原，如HLA-A，B，C和DR以及β2免疫球蛋白，移植后不會產生免疫原性，同時人羊膜細胞又表達HLA-E、G抗原，使其具有免疫抑制活性。
　　 2．人羊膜細胞來源非常廣泛，不會產生倫理或者道德的問題。
　　 3．不具致瘤性。
　　 人們已做了大量的研究工作證明了人羊膜干細胞治療疾病的潛力：Zhao等人發(fā)現人羊膜干細胞移

13、植入心臟后，分化成心肌樣細胞；Sakuragawa等人報道了羊膜上將由PHA激發(fā)的T細胞與AECs和AMSCs共培養(yǎng)，觀察T細胞與兩者的相互作用。
　　 結果：
　　 (1)兩種來源的羊膜細胞均貼壁生長，呈現不同的形態(tài)外觀，兩種細胞均高表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166，但不表達CD34、CD45、HLA-DR。
　　 (2)AMSCs體外能傳代及克隆化培養(yǎng)，AECs則

14、不能，兩種細胞在體外均能誘導向神經元樣細胞方向分化。
　　 (3)兩種來源的羊膜細胞在體外對T細胞的活化增殖有明顯的抑制作用。
　　 結論：
　　 人類AECs和AMSCs具有類似的體外生物學特性、表型、多向分化的潛能及其負性免疫調節(jié)作用，是一類理想的組織工程種子細胞。
　　 第二部分羊膜細胞體外誘導分化及與絲素蛋白支架構建復合體移植對大鼠復合損傷脊髓的修復作用
　　 目的：
　　 探討體

15、外羊膜細胞定向誘導分化的方法，羊膜細胞在生物支架上的生長特點，研究種子細胞移植結合組織工程化技術在神經修復中的運用前景。
　　 方法：
　　 采用酶消化法分離人羊膜組織，分別進行貼壁培養(yǎng)和傳代，通過倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，用流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達作比較性分析，鑒定AECs及AMSCs，并在誘導劑作用下進行細胞分化實驗，重點向少枝膠質細胞方向進行分化干預；構建羊膜細胞與絲素蛋白支架復合體，找到生物支架有利于羊膜

16、細胞生長繁殖的證據；分組進行羊膜細胞移植動物實驗研究，從動物行為學、病理切片、免疫細胞化學法、電鏡檢查等多角度了解組織工程化細胞移植在神經修復方面的積極作用。
　　 結果：
　　 同是來源于羊膜的兩種細胞都呈貼壁生長，但形態(tài)卻迥異，AECs呈鵝卵石樣外觀，邊界清楚，折光性較強，而AMSCs則呈成纖維細胞樣形態(tài)，表面標記物表達的差異在于前者表達上皮細胞標記物CK19而不表達CD49d，后者表達CD49d而不表達CK19。人

17、AECs高表達CD29和CD44說明其具有間充質干細胞的表型特征。羊膜細胞經誘導分化后形成少突膠質細胞樣細胞，多數表達Galc，部分表達MBP。運用掃描電鏡觀察體外絲素蛋白支架復合體細胞的生長情況，發(fā)現支架的三維多孔結構提高了細胞的粘附和增殖能力，細胞呈立體化生長，相互間的突起聯接更多。動物實驗行為學結果表明細胞移植組尤其是結合支架的復合移植組動物行為功能恢復遠較對照組良好，差異有顯著性。組織病理切片及組化實驗表明移植物同宿主間整合良好

18、，移植細胞有存活并向神經細胞轉化證據。神經示蹤技術同樣表明了復合支架移植組有更佳的神經軸索修復表現。動物實驗結果還證實了絲素蛋白支架有著良好的組織相容性，植入支架復合物的損傷脊髓膠質疤痕形成明顯減少，獲得了更好的神經修復。
　　 結論：
　　 羊膜源性干細胞具有多向分化潛能，體外及在體狀態(tài)都有向神經細胞分化的能力，在生物支架材料上羊膜細胞呈現良好的立體化擴增特點，運用羊膜細胞同絲素蛋白支架構建的復合體移植手術對大鼠的脊髓

19、損傷有著更為理想的修復作用。本實驗同時證實在適當轉化條件下羊膜細胞可向少突膠質細胞轉化，動物實驗結果表明，轉化后的終末端神經細胞并未展示出在神經修復方面有更多優(yōu)勢，而結合支架應用的組織工程化復合移植策略明顯有利于軸索再生及髓鞘形成。
　　 第三部分人羊膜細胞負性協同刺激分子PD-L1表達的檢測及對中樞神經系統(tǒng)小膠質細胞活化的調控作用
　　 目的：
　　 探討人羊膜細胞負性協同刺激分子PD-L1的表達及對體外小膠質

20、細胞MI的負性協同作用。
　　 方法：
　　 用原代培養(yǎng)10天左右的AECs及體外擴增3代的AMSCs，采用流式細胞儀和免疫熒光方法來分析兩種細胞協同刺激分子的表達情況,3H-TdR摻入法檢測羊膜細胞對脂多糖刺激后的MI增殖的影響，以及PD-L1單克隆抗體部分阻斷羊膜細胞抑制MI增殖的影響；流式細胞術分析羊膜細胞對脂多糖作用下MI細胞周期的影響，ELISA法檢測細胞因子水平，以及阻斷PD-L1作用后的變化。
　　

21、 結果：
　　 (1)人AECs及AMSCs均不表達CD80、CD83、CD86等正性協同刺激分子，但都較高表達負性分子PD-L1。
　　 (2)AECs及AMSCs均可抑制MI體外增殖，并使脂多糖刺激下的MI滯留于細胞周期的G0/G1期，以及調節(jié)TNF-α、NO等的分泌，由此表明，羊膜細胞介導的負性免疫調節(jié)作用部分是通過高表達PD-L1分子，PD-L1是羊膜細胞表達的主要負性免疫調節(jié)分子。
　　 結論：