低頻脈沖磁場(chǎng)對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景和目的
　　脈沖磁場(chǎng)作為非侵入性物理療法治療骨折延遲愈合在臨床上已經(jīng)取得了良好的效果，研究還表明脈沖磁場(chǎng)能夠明顯促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外血管化。脈沖磁場(chǎng)發(fā)揮生物學(xué)作用有“窗口”效應(yīng)，不同頻率、時(shí)間和強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同影響，尚無(wú)統(tǒng)一的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）和心肌細(xì)胞（CMs）是心臟的主要組成成分，二者的功能受損與心臟病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而內(nèi)皮細(xì)胞的原始細(xì)胞即內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）在治

2、療性血管新生，心臟和血管組織工程中有巨大的應(yīng)用潛力。目前，有關(guān)脈沖磁場(chǎng)對(duì)上述3種細(xì)胞作用的研究尚少。本實(shí)驗(yàn)旨在研究固定頻率和作用時(shí)間時(shí)，不同強(qiáng)度的低頻脈沖磁場(chǎng)（LF-PMFs）對(duì)體外培養(yǎng)大鼠CMECs的增殖、凋亡、超微結(jié)構(gòu)、遷移和成血管能力的影響；對(duì)乳鼠CMs的活力和凋亡的影響以及對(duì)二者共培養(yǎng)條件下CMECs增殖和成血管能力的影響；對(duì)體外培養(yǎng)大鼠骨髓源EPCs的增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移和成血管能力的影響，以尋找該條件下磁場(chǎng)發(fā)揮作用的適

3、宜強(qiáng)度，從而為L(zhǎng)F-PMFs的深入研究和在臨床及心臟組織工程等領(lǐng)域的擴(kuò)展應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　試驗(yàn)方法
　　第一部分：LF-PMFs對(duì)大鼠CMECs，CMs和CMEC-CM共培養(yǎng)的影響
　　1.酶消化法結(jié)合差速貼壁法體外培養(yǎng)大鼠CMECs和CMs，電鏡鑒定內(nèi)皮細(xì)胞表型；
　　2.CMECs和CMs完全隨機(jī)分為四組：對(duì)照組，1.0mT,1.4mT和1.8mT。除對(duì)照組外其余各組用頻率為15Hz不同強(qiáng)度的的方波脈沖

4、磁場(chǎng)刺激細(xì)胞，2h/d，持續(xù)刺激5d。對(duì)照組和曝磁后CMECs組：細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，劃痕試驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)遷移能力，鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架變化，管狀結(jié)構(gòu)形成試驗(yàn)和三維（3D）立體培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞成血管能力；對(duì)照組和曝磁后CMs組：MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡；
　　3.CMEC-CM共培養(yǎng)：MTT法檢測(cè)共培養(yǎng)和非共培養(yǎng)

5、CMECs磁場(chǎng)內(nèi)外增殖情況；
　　4.CMEC-CM共培養(yǎng)3D管樣結(jié)構(gòu)形成試驗(yàn)和HE染色：試驗(yàn)分4組：CMs單獨(dú)3D培養(yǎng)，CMECs單獨(dú)3D培養(yǎng)，CMEC-CM3D共培養(yǎng)，1.4mT刺激下CMEC-CM3D共培養(yǎng)。
　　第二部分：LF-PMFs對(duì)大鼠骨髓源EPCs的影響
　　1.密度梯度離心法獲得大鼠骨髓源EPCs，Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色鑒定EPCs表型；
　　2.EPCs完全隨機(jī)分為四

6、組：對(duì)照組，1.0mT,1.4mT和1.8mT。除對(duì)照組外其余各組用頻率為15Hz不同強(qiáng)度的的方波脈沖磁場(chǎng)刺激細(xì)胞，2h/d，持續(xù)刺激5d。對(duì)照組和曝磁后EPCs組：MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡，劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，管狀結(jié)構(gòu)形成試驗(yàn)和3D培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)胞成血管能力。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.體外成功培養(yǎng)出含內(nèi)皮細(xì)胞特有的超微結(jié)構(gòu)Weible-Palade(WP)小體的CMECs。
　　2.CM

7、ECs經(jīng)1.4mT磁場(chǎng)干預(yù)后加速增殖，生長(zhǎng)曲線峰值提前并提高，DNA合成活躍〔S期與對(duì)照組比較：(13.10±0.15)％vs(3.90±0.18)％，P＜0.01〕，凋亡無(wú)明顯改變，超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)線粒體數(shù)量增多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)等細(xì)胞活性增強(qiáng)表現(xiàn)，細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞遷移面積百分比達(dá)86.1％，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生重組，肌動(dòng)蛋白染色清晰，應(yīng)力纖維增多，并集中在細(xì)胞膜下，管樣結(jié)構(gòu)形成能力增強(qiáng)，3D培養(yǎng)時(shí)血管樣結(jié)構(gòu)密度增加，分枝增長(zhǎng)。
　

8、　3.CMs經(jīng)1.4mT和1.8mT磁場(chǎng)干預(yù)后細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組（0.229±0.021vs0.196±0.012，0.252±0.012vs0.196±0.012，P＜0.05）,凋亡無(wú)明顯改變。
　　4.共培養(yǎng)時(shí)CMs能夠促進(jìn)CMECs增殖，1.4mTLF-PMF對(duì)共培養(yǎng)和非共培養(yǎng)的CMECs同樣起著促進(jìn)增殖作用。在3D培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)二者共培養(yǎng)時(shí)管樣結(jié)構(gòu)較各自單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)數(shù)量增多，密度增大，血管樣結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度也明顯增加，1.4

9、mT磁場(chǎng)干預(yù)后更為顯著。
　　5.體外成功培養(yǎng)出EPCs，并經(jīng)Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1雙染色鑒定證實(shí)。
　　6.1.0mT和1.4mT磁場(chǎng)促進(jìn)EPCs增殖，細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，DNA合成期和合成后期細(xì)胞比例增加，1.8mT磁場(chǎng)也能促進(jìn)EPCs增殖，但對(duì)細(xì)胞周期分布影響不明顯。流式凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)磁場(chǎng)特別是1.0mT和1.4mT磁場(chǎng)刺激能誘導(dǎo)EPCs凋亡。體外培養(yǎng)EPCs遷移能力差，各強(qiáng)度磁場(chǎng)對(duì)其遷移能力也無(wú)明

10、顯影響。不同強(qiáng)度磁場(chǎng)均能夠提高EPCs成血管能力，其中1.0mT和1.4mT作用明顯，1.8mT磁場(chǎng)作用相對(duì)弱。
　　結(jié)論
　　脈沖磁場(chǎng)發(fā)揮生物學(xué)作用的“窗口”效應(yīng)明顯，不同強(qiáng)度磁場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)揮作用不同。
　　15Hz的低強(qiáng)度方波脈沖磁場(chǎng)（特別是1.4mT）對(duì)體外培養(yǎng)的CMECs發(fā)揮促增殖，遷移，提高細(xì)胞活性和成血管能力的積極生物學(xué)效應(yīng)，同時(shí)提高CMs的活力，在CMECs和CMs共培養(yǎng)時(shí)同樣發(fā)揮促CMECs增殖和