17β-雌二醇對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的促血管新生作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的
　　冠心?。–HD）是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。目前,冠心病的治療仍依賴于常規(guī)藥物治療、支架植入術(shù)及冠脈搭橋術(shù)等。雖然支架植入術(shù)及冠脈搭橋術(shù)與常規(guī)藥物治療相比已取得較滿意效果，使部分CHD患者的臨床癥狀和遠(yuǎn)期預(yù)后得到明顯改善，但這些方法存在費(fèi)用高昂、手術(shù)復(fù)雜、有危險(xiǎn)性以及術(shù)后再狹窄等問(wèn)題，且有相當(dāng)多患者(20％～37％)因故不能做PTCA和
　　CABG。因此探索新的治療方法和途徑顯得尤為重要。近l0年來(lái)，動(dòng)物

2、試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)已表明，治療性血管新生治療冠心病不啻為較有前途的新方法。治療性血管新生（TherapeuticAngiogenesis）是指使缺血組織在原有微血管基礎(chǔ)上形成新毛細(xì)血管，并與原有冠狀血管網(wǎng)相交匯，在缺血的心肌區(qū)域架起新的血管橋，改善心肌供血的一種方法，系人為地通過(guò)各種方法提高病變部位血管新生誘導(dǎo)因子的濃度，促進(jìn)局部血管新生（指由原已存在的毛細(xì)血管通過(guò)出芽或內(nèi)填形成新的毛細(xì)血管），提高心肌血液供應(yīng)代償能力，最終達(dá)到治療冠心病的

3、目的。現(xiàn)有的治療性血管新生治療手段，主要包括應(yīng)用生長(zhǎng)因子直接注射或其基因轉(zhuǎn)染，干細(xì)胞移植及藥物治療等。但生長(zhǎng)因子的體內(nèi)半衰期短和價(jià)格昂貴，并且還可能有某些潛在的嚴(yán)重毒副作用，加之受患者經(jīng)濟(jì)實(shí)力及基層條件的限制。用藥物促進(jìn)血管新生，刺激缺血區(qū)小血管生長(zhǎng)，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成，完成缺血區(qū)血管的自我搭橋便成了十分誘人的治療方法。因此，深入研究血管新生的機(jī)制和開(kāi)發(fā)有效的血管新生藥物，成為目前治療性血管新生的熱點(diǎn)課題。眾所周知內(nèi)源性雌激素對(duì)女性有降低

4、低密度脂蛋白、抗動(dòng)脈粥樣硬化、擴(kuò)張血管等心臟保護(hù)作用，新近研究發(fā)現(xiàn),17β-雌二醇（17β-E2）可加速臍靜脈及牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖,從而強(qiáng)化血管的生成效應(yīng)。但有關(guān)17β-E2對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMEC）的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因?yàn)椴煌M織器官的微血管內(nèi)皮細(xì)胞存在差異，因此本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠CMEC為研究對(duì)象，觀察17β-E2對(duì)大鼠CMEC的增殖、遷移、及管樣結(jié)構(gòu)形成的影響，從而為探討17β-E2在冠心病中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及

5、理論依據(jù)。
　　方法
　　第一部分：CMEC的分離培養(yǎng)及表型鑒定。
　　1．取SD雌性大鼠左心室，在75％乙醇中浸泡20s滅活心內(nèi)、外膜大血管內(nèi)皮細(xì)胞，以密度梯度離心及黏附細(xì)胞法分離出大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在15％小牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并定期觀察；2．免疫熒光雙染，鑒定細(xì)胞表型。
　　第二部分：大鼠CMEC雌激素受體（ER）表達(dá)的測(cè)定。
　　免疫熒光法檢測(cè)雌性SD大鼠CMEC內(nèi)是否有ER的表達(dá)。<

6、br>　　第三部分：17β-雌二醇對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的促血管新生作用及其機(jī)制研究。
　　1.取培養(yǎng)6天的細(xì)胞，分別給予不同濃度的17β-E2，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力并選擇最佳濃度。
　　2.用最佳濃度的17β-E2及17β-E2拮抗劑他莫昔芬進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：2.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)17β-E2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；2.2細(xì)胞侵入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)17β-E2對(duì)細(xì)胞侵入能力的影響；2.3管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)17β-E2對(duì)細(xì)胞分化情況的

7、影響；2.4ELISA法檢測(cè)17β-E2對(duì)細(xì)胞分泌VEGF的影響。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)值均以±s表示。數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)x分析，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)一步比較。
　　結(jié)果
　　1.CMEC免疫熒光染色可見(jiàn)VonWille-brand因子染色陽(yáng)性,Dil-Ac-LDL吞噬實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。證實(shí)所得細(xì)胞為心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.經(jīng)免疫熒光染色分析，

8、陰性對(duì)照組沒(méi)有熒光產(chǎn)生，而加有一抗為ER單克隆抗體的細(xì)胞則被標(biāo)記上了熒光。熒光顯微鏡觀察表明心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在雌激素受體。
　　3.與對(duì)照組相比，17β-E2濃度在0．001～1μmol／L，作用24h后，可明顯促進(jìn)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，有顯著性差異（P<0.05），且在濃度為0.01μmol／L時(shí)效果最佳；17β-E2+他莫昔芬處理組，無(wú)顯著性差異（P＞0.05），對(duì)CMEC的增殖無(wú)影響。
　　4.細(xì)胞劃痕法

9、檢測(cè)17β-E2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。與對(duì)照組相比，細(xì)胞劃痕后，17β-E2（0.01）μmol／L干預(yù)12小時(shí)，劃痕區(qū)相對(duì)距離明顯減小，差異有顯著性意義(P<0.05)，細(xì)胞遷移率為53％；17β-E2+他莫昔芬干預(yù)12小時(shí)，劃痕區(qū)相對(duì)距離無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　5.Millicell小室測(cè)定法檢測(cè)17β-E2對(duì)細(xì)胞侵入能力的影響，17β-E2能很大程度的誘導(dǎo)CMEC由微孔濾膜上層侵入到下層，且與對(duì)照組相比有顯著性差異

10、（P<0.05）；而17β-E2拮抗劑他莫昔芬可以阻斷此作用。
　　6.與對(duì)照組比較，17β-E2組形成管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)目明顯增多，小管間距明顯減小，并交織成網(wǎng)狀，圖像經(jīng)量化分析后發(fā)現(xiàn)：管狀分支點(diǎn)的平均數(shù)目對(duì)照組為12個(gè)/視野，17β-E2組為23個(gè)/視野，與對(duì)照組比較P<0.01，17β-E2+他莫昔芬組為12個(gè)/視野，與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　7.17β-E2濃度在0.01μmol/L時(shí)，可明顯促進(jìn)大鼠

11、心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的分泌，且與對(duì)照組比有顯著性差異（P<0.01）。對(duì)照組和17β-E2+他莫昔芬處理組培養(yǎng)的CMEC上清液中VEGF濃度極低，且兩組間比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論
　　1.通過(guò)取材部位、分離方法及細(xì)胞鑒定，本實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞為心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在雌激素受體。
　　3.17β-E2可明顯促進(jìn)CMEC的增殖，在其濃度為0.01μmol/L時(shí)產(chǎn)生最

12、大增殖效應(yīng)，17β-E2受體拮抗劑他莫昔芬可阻斷此效應(yīng)。
　　4.17β-E2可促進(jìn)CMEC遷移、侵入及分化成管樣結(jié)構(gòu)，17β-E2受體拮抗劑他莫昔芬可阻斷此效應(yīng)。
　　5.與對(duì)照組及17β-E2+他莫昔芬組相比，17β-E2可明顯促進(jìn)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的分泌（P<0.01），他莫昔芬可阻斷此效應(yīng)。
　　6.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，適當(dāng)濃度的17β-E2有促進(jìn)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的作用，這為17β-E2應(yīng)