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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
據(jù)中山大學(xué)相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析研究,目前我國(guó)女性卵巢癌發(fā)病率高達(dá)6.1/10萬(wàn),約占卵巢腫瘤總數(shù)的5%。雖然我國(guó)卵巢癌發(fā)病率低于歐洲、北美等發(fā)達(dá)國(guó)家,但據(jù)統(tǒng)計(jì)分析目前我國(guó)香港、廣州和上海等沿海大城市發(fā)病率明顯高于內(nèi)地中心城市,而且生活富足地區(qū)的女性發(fā)病率明顯增高,可能與飲食中高脂肪高蛋白攝取有關(guān),尤其是食物中動(dòng)物脂肪含量高有關(guān)。因此近年來(lái),我們與發(fā)達(dá)國(guó)家間卵巢癌的發(fā)病率差距逐漸減小。卵巢癌中卵巢原發(fā)性癌的比例約占90%-9
2、5%,另外5%-10%為其他部位原發(fā)的癌轉(zhuǎn)移至卵巢。由于卵巢癌早期臨床癥狀少且不典型,缺乏特異性,同時(shí)門(mén)診篩查有限,導(dǎo)致其早期診斷較困難,約70%左右的患者就診時(shí)已為晚期。因此,雖然卵巢癌的發(fā)病率僅位于婦科惡性腫瘤第三位,低于官頸癌和子宮內(nèi)膜癌,但其死亡率卻超過(guò)宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌之和,高居?jì)D科癌癥首位,嚴(yán)重威脅婦女健康。所以,早期發(fā)現(xiàn)是卵巢癌治療的關(guān)鍵。探索卵巢癌早期敏感標(biāo)志物,同時(shí)利用生物學(xué)治療是目前卵巢癌研究的熱點(diǎn)。
3、卵巢癌的發(fā)生包括多基因、多階段相互作用的復(fù)雜過(guò)程。癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤生長(zhǎng)的決定因素。ARHI基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一,其在正常乳腺、卵巢、胰腺組織中均高表達(dá)。我們2006年前期試驗(yàn)結(jié)果表明在卵巢腫瘤中ARHI基因表達(dá)下調(diào),在卵巢癌中缺失率高達(dá)67%。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究也表明ARHI參與了胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。
目前對(duì)于晚期卵巢癌的治療,手術(shù)往往達(dá)不到滿(mǎn)意效果,甚至無(wú)法行手術(shù)治療,需依賴(lài)輔助化療
4、。隨著化療藥物廣泛應(yīng)用,卵巢癌的耐藥嚴(yán)重影響療效。因此逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥是目前研究熱點(diǎn)。
目的:
建立ARHI基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)的卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/DDP,觀察轉(zhuǎn)染前后ARHI基因的表達(dá);探討ARHI基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠A2780/DDP移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用,研究順鉑對(duì)裸鼠荷瘤生長(zhǎng)的影響;探討ARHI基因轉(zhuǎn)染對(duì)A2780細(xì)胞周期及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
第一部分:ARHI基因在A2780細(xì)胞中的表達(dá)
5、及意義
方法:常規(guī)培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780及A2780/DDP,應(yīng)用RT-PCR和Westernblot方法測(cè)定ARHI在兩種細(xì)胞系內(nèi)的基因和蛋白表達(dá)。構(gòu)建ARHI基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-ARHI,以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞株A2780、A2780/DDP,同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1質(zhì)粒,以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照;轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株分別命名為ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP,p
6、EGFP-C1/A2780和pEGFP-C1/A2780/DDP。應(yīng)用RT-PCR、Westernblot方法分析ARHI基因及其蛋白表達(dá)。應(yīng)用T檢驗(yàn)A2780及A2780/DDP兩種細(xì)胞中ARHI基因差別。應(yīng)用秩和檢驗(yàn)對(duì)比研究A2780及A2780/DDP轉(zhuǎn)染前后目的基因的差別,同時(shí)橫向?qū)Ρ绒D(zhuǎn)染后ARHI/A2780組、ARHI/A2780/DDP組目的基因的差別。所有結(jié)果均以P小于0.05作為臨界值。
結(jié)果:
7、 1、ARHI基因在A2780和A2780/DDP細(xì)胞株中表達(dá)
應(yīng)用RT-PCR及Westernblot分別檢測(cè)ARHI基因在A2780及A2780/DDP中mRNA及蛋白表達(dá),結(jié)果顯示ARHI存在低表達(dá)和缺失。RT-PCR檢測(cè)A2780細(xì)胞株可發(fā)現(xiàn)ARHI弱表達(dá),平均表達(dá)水平為0.027±0.01,A2780/DDP表達(dá)缺失。Wsesternblot檢測(cè)A2780組蛋白表達(dá),A2780/DDP組無(wú)蛋白表達(dá)。應(yīng)用配對(duì)T
8、檢驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后A2780、A2780/DDP細(xì)胞ARHI基因mRNA及蛋白表達(dá),兩組差異具有顯著性(p<0.05)。
2、ARHI基因在ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP細(xì)胞株中表達(dá)
ARHI基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)的A2780,A2780/DDP細(xì)胞株,利用RT-PCR及Westernblot檢測(cè)ARHI基因mRNA及蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:ARHI/A2780組、ARHI/A2780/DDP組ARH
9、ImRNA表達(dá)均為陽(yáng)性,平均表達(dá)水平分別為0.086±0.01,0.081±0.01;A2780空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組也可檢測(cè)到ARHI基因mRNA表達(dá),表達(dá)水平為0.029±0.01。A2780/DDP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組無(wú)ARHI基因及蛋白表達(dá)。對(duì)比轉(zhuǎn)染穩(wěn)定ARHI/A2780及ARHI/A2780/DDP細(xì)胞株,兩者轉(zhuǎn)染后差異無(wú)顯著性(P>0.05)。
結(jié)論:
1、ARHI基因在A2780、A2780/DDP細(xì)胞中低表達(dá)
10、或缺失,ARHI基因與卵巢癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。
2、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)ARHI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,可得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆,轉(zhuǎn)染成功后可提高目的基因的表達(dá)。
第二部分:ARHI基因?qū)β闶驛2780/DDP移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究
方法:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ARHI/A2780/DDP組,pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組三組細(xì)胞系,在裸鼠右前肢根部皮下(腋窩)注射種植;觀察ARHI對(duì)A27
11、80/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影響。利用westernblot方法檢測(cè)裸鼠移植瘤體內(nèi)ARHI表達(dá)。應(yīng)用順鉑小劑量單藥化療干預(yù)各組瘤細(xì)胞種植裸鼠,順鉑作用途徑分兩組腹腔注射、尾靜脈注射。觀察順鉑對(duì)裸鼠移植瘤體生長(zhǎng)的影響。
結(jié)果:
1、ARHI基因?qū)2780/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影響
ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組細(xì)胞傳代,于裸
12、鼠腋窩皮下注射。接種10-12天后觀察pEGFP-C1/A2780/DDP(n=8)組和A2780/DDP(n=8)組所有裸鼠均成瘤,成瘤率達(dá)100%,瘤體體積在100mm3左右,觀察瘤體生長(zhǎng)速度較快。ARHI/A2780/DDP(n=8)組接種后,12天內(nèi)僅1只裸鼠腋下有瘤體生成,但瘤體體積在30mm3,30天左右僅有3只裸鼠瘤體生成,早期瘤體增大至50mm3,后期兩瘤體體積很小,肉眼觀察較困難。
2、ARHI基因在A2
13、780/DDP裸鼠移植瘤內(nèi)的表達(dá)
裸鼠移植瘤體成瘤穩(wěn)定后5-7天,處置各組裸鼠,應(yīng)用westernblot檢測(cè)各組瘤體內(nèi)ARHI差異,結(jié)果顯示:ARHI/A2780/DDP組瘤體可見(jiàn)明顯ARHI表達(dá),pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組ARHI低表達(dá)或缺失。秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARHI/A2780/DDP組與空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。pEGFP-C1/A2780/DDP組和
14、A2780/DDP組之間無(wú)明顯差別。
3、ARHI基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響
分別應(yīng)用順鉑腹腔注射和尾靜脈注射兩種方法作用于三組裸鼠,觀察7天,處置裸鼠,解剖裸鼠腋窩及腹腔。結(jié)果顯示:順鉑作用后瘤體生長(zhǎng)速度明顯減慢。ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組瘤體均有不同程度的變性壞死,瘤體體積及重量較基礎(chǔ)體積及重量降低。ARHI/A2780/DDP組
15、與其余兩組間差異顯著(p<0.05)。三組裸鼠處死后均未見(jiàn)明顯腹腔轉(zhuǎn)移,無(wú)明顯腹水形成。腹腔注射組與尾靜脈注射組兩者之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。
結(jié)論:
1、ARHI基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以抑制裸鼠體內(nèi)A2780/DDP移植瘤的形成及生長(zhǎng)。
2、ARHI基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑治療可明顯抑制A2780/DDP移植瘤的生長(zhǎng)。
第三部分:ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞周期和侵襲能力的影響
16、r> 方法:轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的三組細(xì)胞系A(chǔ)RHI/A2780/DDP,pEGFP-C1/A2780/DDP和A2780/DDP,穩(wěn)定傳代,分別針對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲機(jī)制進(jìn)行如下研究:流式細(xì)胞儀PI染色方法檢測(cè)ARHI基因和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響。應(yīng)用MTT和生長(zhǎng)曲線分析ARHI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀PI染色檢測(cè)ARHI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)ARHI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞遷移的影響。應(yīng)用Wws
17、ternblot方法檢測(cè)ARHI基因?qū)I3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)的影響。
結(jié)果:
1、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞周期的影響
應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色方法檢測(cè)ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組細(xì)胞周期的變化,結(jié)果顯示:停滯于G1期細(xì)胞由A2780/DDP的51%,pEGFP-C1/A2780/DD
18、P的55%上升至ARHI組的69%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ARHI組與空載體及未轉(zhuǎn)染兩組比較差異顯著(p<0.05),A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組之間無(wú)顯著差異(p>0.05)。
2、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞增殖的影響
應(yīng)用MTT檢測(cè)ARHI/A2780/DDP、pEGFP-C1/A2780/DDP和A2780/DDP三組細(xì)胞細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示:在第5天時(shí)檢測(cè)A2780/D
19、DP組及空載體組細(xì)胞較第一天增長(zhǎng)5-6倍,ARHI組僅增長(zhǎng)3倍左右。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ARHI組與其余兩組差異顯著。A2780/DDP組,空載體組無(wú)明顯差異。
3、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞凋亡的影響
應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色檢測(cè)A2780/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后凋亡率,結(jié)果顯示:細(xì)胞凋亡率在A2780/DDP組、空載體組分別為11.1%、11.7%,ARHI組為29.9%。ARHI轉(zhuǎn)染顯著增加腫瘤細(xì)胞凋亡率(p
20、<0.05)。
4、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞遷移的影響
應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)A2780/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后遷移能力,結(jié)果顯示:細(xì)胞遷移率在A2780/DDP組,空載體組無(wú)顯著差異,但ARHI組細(xì)胞遷移率顯著減慢(p<0.05)。
5、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)的影響
應(yīng)用westernblot方法檢
21、測(cè)三組細(xì)胞株中磷酸化AKT的表達(dá),結(jié)果證實(shí)ARHI組P-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)。在ARHI轉(zhuǎn)染組中DAPK1蛋白表達(dá)比A2780/DDP組、空載體組上調(diào)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ARHI轉(zhuǎn)染組與其余兩組差別具有顯著意義。
結(jié)論:
1、ARHI基因使A2780/DDP細(xì)胞停滯于G1期,抑制細(xì)胞增殖,增強(qiáng)細(xì)胞凋亡,減緩細(xì)胞的侵襲性。
2、ARHI基因通過(guò)增加P-AKT蛋白及DAPK1蛋白表達(dá),阻斷PI3K/AKT信號(hào)
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