ARHI基因?qū)2780細(xì)胞及裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究.pdf

1、背景：
　　 據(jù)中山大學(xué)相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析研究，目前我國(guó)女性卵巢癌發(fā)病率高達(dá)6.1/10萬(wàn)，約占卵巢腫瘤總數(shù)的5％。雖然我國(guó)卵巢癌發(fā)病率低于歐洲、北美等發(fā)達(dá)國(guó)家，但據(jù)統(tǒng)計(jì)分析目前我國(guó)香港、廣州和上海等沿海大城市發(fā)病率明顯高于內(nèi)地中心城市，而且生活富足地區(qū)的女性發(fā)病率明顯增高，可能與飲食中高脂肪高蛋白攝取有關(guān)，尤其是食物中動(dòng)物脂肪含量高有關(guān)。因此近年來(lái)，我們與發(fā)達(dá)國(guó)家間卵巢癌的發(fā)病率差距逐漸減小。卵巢癌中卵巢原發(fā)性癌的比例約占90％-9

2、5％，另外5％-10％為其他部位原發(fā)的癌轉(zhuǎn)移至卵巢。由于卵巢癌早期臨床癥狀少且不典型，缺乏特異性，同時(shí)門(mén)診篩查有限，導(dǎo)致其早期診斷較困難，約70％左右的患者就診時(shí)已為晚期。因此，雖然卵巢癌的發(fā)病率僅位于婦科惡性腫瘤第三位，低于官頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但其死亡率卻超過(guò)宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌之和，高居?jì)D科癌癥首位，嚴(yán)重威脅婦女健康。所以，早期發(fā)現(xiàn)是卵巢癌治療的關(guān)鍵。探索卵巢癌早期敏感標(biāo)志物，同時(shí)利用生物學(xué)治療是目前卵巢癌研究的熱點(diǎn)。
　　

3、卵巢癌的發(fā)生包括多基因、多階段相互作用的復(fù)雜過(guò)程。癌基因的激活和抑癌基因的失活是腫瘤生長(zhǎng)的決定因素。ARHI基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，其在正常乳腺、卵巢、胰腺組織中均高表達(dá)。我們2006年前期試驗(yàn)結(jié)果表明在卵巢腫瘤中ARHI基因表達(dá)下調(diào)，在卵巢癌中缺失率高達(dá)67％。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究也表明ARHI參與了胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 目前對(duì)于晚期卵巢癌的治療，手術(shù)往往達(dá)不到滿(mǎn)意效果，甚至無(wú)法行手術(shù)治療，需依賴(lài)輔助化療

4、。隨著化療藥物廣泛應(yīng)用，卵巢癌的耐藥嚴(yán)重影響療效。因此逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥是目前研究熱點(diǎn)。
　　 目的：
　　 建立ARHI基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)的卵巢癌耐藥細(xì)胞株A2780/DDP，觀察轉(zhuǎn)染前后ARHI基因的表達(dá);探討ARHI基因轉(zhuǎn)染對(duì)裸鼠A2780/DDP移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用，研究順鉑對(duì)裸鼠荷瘤生長(zhǎng)的影響;探討ARHI基因轉(zhuǎn)染對(duì)A2780細(xì)胞周期及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 第一部分：ARHI基因在A2780細(xì)胞中的表達(dá)

5、及意義
　　 方法:常規(guī)培養(yǎng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780及A2780/DDP，應(yīng)用RT-PCR和Westernblot方法測(cè)定ARHI在兩種細(xì)胞系內(nèi)的基因和蛋白表達(dá)。構(gòu)建ARHI基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1-ARHI，以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人卵巢癌細(xì)胞株A2780、A2780/DDP，同時(shí)轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-C1質(zhì)粒，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對(duì)照;轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株分別命名為ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP，p

6、EGFP-C1/A2780和pEGFP-C1/A2780/DDP。應(yīng)用RT-PCR、Westernblot方法分析ARHI基因及其蛋白表達(dá)。應(yīng)用T檢驗(yàn)A2780及A2780/DDP兩種細(xì)胞中ARHI基因差別。應(yīng)用秩和檢驗(yàn)對(duì)比研究A2780及A2780/DDP轉(zhuǎn)染前后目的基因的差別，同時(shí)橫向?qū)Ρ绒D(zhuǎn)染后ARHI/A2780組、ARHI/A2780/DDP組目的基因的差別。所有結(jié)果均以P小于0.05作為臨界值。
　　 結(jié)果:
　

7、　 1、ARHI基因在A2780和A2780/DDP細(xì)胞株中表達(dá)
　　 應(yīng)用RT-PCR及Westernblot分別檢測(cè)ARHI基因在A2780及A2780/DDP中mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示ARHI存在低表達(dá)和缺失。RT-PCR檢測(cè)A2780細(xì)胞株可發(fā)現(xiàn)ARHI弱表達(dá)，平均表達(dá)水平為0.027±0.01，A2780/DDP表達(dá)缺失。Wsesternblot檢測(cè)A2780組蛋白表達(dá)，A2780/DDP組無(wú)蛋白表達(dá)。應(yīng)用配對(duì)T

8、檢驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后A2780、A2780/DDP細(xì)胞ARHI基因mRNA及蛋白表達(dá)，兩組差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　 2、ARHI基因在ARHI/A2780、ARHI/A2780/DDP細(xì)胞株中表達(dá)
　　 ARHI基因轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)的A2780，A2780/DDP細(xì)胞株，利用RT-PCR及Westernblot檢測(cè)ARHI基因mRNA及蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:ARHI/A2780組、ARHI/A2780/DDP組ARH

9、ImRNA表達(dá)均為陽(yáng)性，平均表達(dá)水平分別為0.086±0.01，0.081±0.01;A2780空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組也可檢測(cè)到ARHI基因mRNA表達(dá)，表達(dá)水平為0.029±0.01。A2780/DDP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組無(wú)ARHI基因及蛋白表達(dá)。對(duì)比轉(zhuǎn)染穩(wěn)定ARHI/A2780及ARHI/A2780/DDP細(xì)胞株，兩者轉(zhuǎn)染后差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、ARHI基因在A2780、A2780/DDP細(xì)胞中低表達(dá)

10、或缺失，ARHI基因與卵巢癌細(xì)胞耐藥有關(guān)。
　　 2、利用脂質(zhì)體介導(dǎo)ARHI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，可得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)染成功后可提高目的基因的表達(dá)。
　　 第二部分：ARHI基因?qū)β闶驛2780/DDP移植瘤生長(zhǎng)抑制作用的研究
　　 方法:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ARHI/A2780/DDP組，pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組三組細(xì)胞系，在裸鼠右前肢根部皮下（腋窩）注射種植;觀察ARHI對(duì)A27

11、80/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影響。利用westernblot方法檢測(cè)裸鼠移植瘤體內(nèi)ARHI表達(dá)。應(yīng)用順鉑小劑量單藥化療干預(yù)各組瘤細(xì)胞種植裸鼠，順鉑作用途徑分兩組腹腔注射、尾靜脈注射。觀察順鉑對(duì)裸鼠移植瘤體生長(zhǎng)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、ARHI基因?qū)2780/DDP裸鼠移植瘤成瘤能力的影響
　　 ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組細(xì)胞傳代，于裸

12、鼠腋窩皮下注射。接種10-12天后觀察pEGFP-C1/A2780/DDP(n=8)組和A2780/DDP(n=8)組所有裸鼠均成瘤，成瘤率達(dá)100％，瘤體體積在100mm3左右，觀察瘤體生長(zhǎng)速度較快。ARHI/A2780/DDP(n=8)組接種后，12天內(nèi)僅1只裸鼠腋下有瘤體生成，但瘤體體積在30mm3，30天左右僅有3只裸鼠瘤體生成，早期瘤體增大至50mm3，后期兩瘤體體積很小，肉眼觀察較困難。
　　 2、ARHI基因在A2

13、780/DDP裸鼠移植瘤內(nèi)的表達(dá)
　　 裸鼠移植瘤體成瘤穩(wěn)定后5-7天，處置各組裸鼠，應(yīng)用westernblot檢測(cè)各組瘤體內(nèi)ARHI差異，結(jié)果顯示:ARHI/A2780/DDP組瘤體可見(jiàn)明顯ARHI表達(dá)，pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組ARHI低表達(dá)或缺失。秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARHI/A2780/DDP組與空載體轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。pEGFP-C1/A2780/DDP組和

14、A2780/DDP組之間無(wú)明顯差別。
　　 3、ARHI基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)影響
　　 分別應(yīng)用順鉑腹腔注射和尾靜脈注射兩種方法作用于三組裸鼠，觀察7天，處置裸鼠，解剖裸鼠腋窩及腹腔。結(jié)果顯示:順鉑作用后瘤體生長(zhǎng)速度明顯減慢。ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組瘤體均有不同程度的變性壞死，瘤體體積及重量較基礎(chǔ)體積及重量降低。ARHI/A2780/DDP組

15、與其余兩組間差異顯著(p＜0.05)。三組裸鼠處死后均未見(jiàn)明顯腹腔轉(zhuǎn)移，無(wú)明顯腹水形成。腹腔注射組與尾靜脈注射組兩者之間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、ARHI基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以抑制裸鼠體內(nèi)A2780/DDP移植瘤的形成及生長(zhǎng)。
　　 2、ARHI基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合順鉑治療可明顯抑制A2780/DDP移植瘤的生長(zhǎng)。
　　 第三部分：ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞周期和侵襲能力的影響

16、r>　　 方法:轉(zhuǎn)染穩(wěn)定的三組細(xì)胞系A(chǔ)RHI/A2780/DDP，pEGFP-C1/A2780/DDP和A2780/DDP，穩(wěn)定傳代，分別針對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲機(jī)制進(jìn)行如下研究:流式細(xì)胞儀PI染色方法檢測(cè)ARHI基因和空載體轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響。應(yīng)用MTT和生長(zhǎng)曲線分析ARHI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞儀PI染色檢測(cè)ARHI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞凋亡的影響。應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)ARHI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞遷移的影響。應(yīng)用Wws

17、ternblot方法檢測(cè)ARHI基因?qū)I3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞周期的影響
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色方法檢測(cè)ARHI/A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組和A2780/DDP組細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示:停滯于G1期細(xì)胞由A2780/DDP的51％，pEGFP-C1/A2780/DD

18、P的55％上升至ARHI組的69％。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ARHI組與空載體及未轉(zhuǎn)染兩組比較差異顯著(p＜0.05)，A2780/DDP組、pEGFP-C1/A2780/DDP組之間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。
　　 2、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞增殖的影響
　　 應(yīng)用MTT檢測(cè)ARHI/A2780/DDP、pEGFP-C1/A2780/DDP和A2780/DDP三組細(xì)胞細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示:在第5天時(shí)檢測(cè)A2780/D

19、DP組及空載體組細(xì)胞較第一天增長(zhǎng)5-6倍，ARHI組僅增長(zhǎng)3倍左右。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ARHI組與其余兩組差異顯著。A2780/DDP組，空載體組無(wú)明顯差異。
　　 3、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞凋亡的影響
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞儀PI染色檢測(cè)A2780/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后凋亡率，結(jié)果顯示:細(xì)胞凋亡率在A2780/DDP組、空載體組分別為11.1％、11.7％，ARHI組為29.9％。ARHI轉(zhuǎn)染顯著增加腫瘤細(xì)胞凋亡率(p

20、＜0.05)。
　　 4、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞遷移的影響
　　 應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)A2780/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后遷移能力，結(jié)果顯示:細(xì)胞遷移率在A2780/DDP組，空載體組無(wú)顯著差異，但ARHI組細(xì)胞遷移率顯著減慢(p＜0.05)。
　　 5、ARHI基因?qū)2780/DDP細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)的影響
　　 應(yīng)用westernblot方法檢

21、測(cè)三組細(xì)胞株中磷酸化AKT的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)ARHI組P-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)。在ARHI轉(zhuǎn)染組中DAPK1蛋白表達(dá)比A2780/DDP組、空載體組上調(diào)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ARHI轉(zhuǎn)染組與其余兩組差別具有顯著意義。
　　 結(jié)論：
　　 1、ARHI基因使A2780/DDP細(xì)胞停滯于G1期，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，減緩細(xì)胞的侵襲性。
　　 2、ARHI基因通過(guò)增加P-AKT蛋白及DAPK1蛋白表達(dá)，阻斷PI3K/AKT信號(hào)