穿龍薯蕷皂苷對膠原誘導性關節(jié)炎小鼠CD4+T細胞亞群平衡的影響及其調(diào)控機制研究.pdf

1、類風濕性關節(jié)炎是一種常見的自身免疫病，病變特點為慢性侵蝕性關節(jié)炎，以及由此造成的關節(jié)軟骨和骨質(zhì)破壞，如不治療，疾病逐漸發(fā)展，最后可導致關節(jié)畸形。CD4+T細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在疾病的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。CD4+T細胞按照其功能的不同可以分為Th1、Th2、Th17和Treg細胞。早期研究認為RA發(fā)病主要與Th1細胞相關。但近期研究發(fā)現(xiàn)，Th1、Th2、Th17和Treg細胞均與RA的發(fā)生密切相關。
　　穿山龍是

2、薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的根莖，民間多用其浸酒或煎服，治療筋骨麻木和腰酸腰痛。薯蕷皂苷（dioscin）是從穿龍薯蕷中分離得到的甾體皂苷，是生產(chǎn)多種激素類藥物的重要原料,同時也被認為是許多中藥復方的主要活性成分，如維奧欣片、地奧心血康膠囊?，F(xiàn)代藥理學研究證實，薯蕷皂苷具有多種生物活性作用?？梢钥隙?，薯蕷皂苷是一種很有潛力的藥物。
　　目的：
　　研究穿龍薯蕷皂苷對雞Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)小鼠CD4+T細胞亞群平衡的影

3、響及其具體調(diào)控機制，初步明確穿龍薯蕷皂苷對 CIA小鼠產(chǎn)生治療作用的機制，為薯蕷皂苷的進一步研究及臨床應用提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　采用隨機數(shù)字表法將72只DBA1/J小鼠分為對照組、模型組、薯蕷皂苷組、雷公藤組，用制備的Ⅱ型膠原乳劑免疫模型組、薯蕷皂苷組和雷公藤組小鼠,第21天相同劑量加強1次。對照組按照上述方法注射等量生理鹽水。從初次免疫第22天開始，薯蕷皂苷組灌胃給予100mg/kg/d穿龍薯蕷皂苷混懸液，

4、雷公藤組根據(jù)說明書按照人/鼠體表面積比值灌胃給予含雷公藤甲素的雷公藤片混懸液（按雷公藤甲素計17μg/kg/d），對照組和模型組給予等體積溶媒。初次免疫第35天處死小鼠，無菌取腹股溝淋巴結(jié)，制成單細胞懸液，用流式細胞術檢測CD4+T細胞亞群Th1、Th2、Th17、Treg細胞的百分率；用western blot技術檢測信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子p-STAT1、p-STAT3、p-STAT4、p-STAT5、p-STAT6和細胞因子信號轉(zhuǎn)導

5、負調(diào)控蛋白SOCS3的含量；用實時熒光定量PCR技術檢測轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγt、Foxp3的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、體重、足爪腫脹度及AI值變化
　　對照組小鼠體重穩(wěn)定增長，而模型組小鼠因為關節(jié)發(fā)病，體重下降明顯（P<0.05），薯蕷皂苷組小鼠體重對比對照組小鼠體重下降明顯（P<0.05），但和模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。雷公藤組小鼠和薯蕷皂苷組小鼠體重變化情況相似。

6、　　對照組小鼠足墊厚度在實驗過程中無顯著變化，穩(wěn)定在1.40 mm左右，而模型組小鼠足墊到35天達到1.99 mm，與關節(jié)炎癥嚴重程度一致，與對照組小鼠相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。薯蕷皂苷組小鼠足墊厚度上升幅度較模型組為輕，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。雷公藤組小鼠足爪腫脹情況最輕，第35天足墊厚度只有1.72 mm。與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。雷公藤組小鼠和薯蕷皂苷組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義

7、（P>0.05）。
　　對照組小鼠足爪無紅腫表現(xiàn)，AI值在實驗過程中一直為0，而模型組小鼠第35天 AI指數(shù)達到11.84，與對照組小鼠對比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。薯蕷皂苷組小鼠關節(jié)炎指數(shù)相比模型組有明顯改善（P<0.05）。雷公藤組小鼠關節(jié)炎指數(shù)最小，癥狀最輕，相比模型組改善明顯（P<0.05）。雷公藤組小鼠和薯蕷皂苷組小鼠相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　2、流式細胞術檢測Th1、Th2、Th17、T

8、reg細胞的百分率
　　與對照組相比，模型組Th1細胞比率明顯升高（P<0.05），薯蕷皂苷組相比模型組則顯著降低（P<0.05）。對照組和模型組相比，Th2細胞比率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），薯蕷皂苷組則高于模型組（P<0.05）。與對照組相比，模型組Th17細胞比率顯著升高（P<0.05），薯蕷皂苷組則顯著降低（P<0.05）。對照組和模型組相比，Treg細胞比率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與模型組相比，薯蕷皂苷組

9、Treg細胞比率顯著升高（P<0.05）。
　　3、western blot技術檢測p-STAT1、p-STAT3、p-STAT4、p-STAT5、p-STAT6和SOCS3的含量
　　模型組與對照組相比，p-STAT1顯著升高（P<0.05）。模型組相比對照組p-STAT3顯著升高（P<0.05），薯蕷皂苷組與模型組相比則顯著下降（P<0.05），而雷公藤組下降較薯蕷皂苷組小。模型組與對照組對比，p-STAT4顯著升高（P

10、<0.05），薯蕷皂苷組則明顯下降（P<0.05），雷公藤組較薯蕷皂苷組更為降低。模型組相比對照組p-STAT5顯著升高（P<0.05），薯蕷皂苷組對比模型組顯著升高，雷公藤組升高較小。與對照組相比，薯蕷皂苷組p-STAT6明顯升高（P<0.05）。與對照組相比，模型組、薯蕷皂苷組和雷公藤組SOCS3顯著升高（P<0.05），薯蕷皂苷組和模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）而雷公藤組和模型組相比則明顯升高。
　　4、實時熒光

11、定量PCR技術檢測轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγt、Foxp3的表達情況
　　模型組與對照組相比，T-bet顯著升高（P<0.05）。模型組與對照組相比 GATA-3差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）,薯蕷皂苷組和雷公藤組與模型組相比顯著升高（P<0.05），薯蕷皂苷組升高更為明顯（P<0.05）。模型組與對照組相比，RORγt顯著升高（P<0.05），薯蕷皂苷組和雷公藤組與模型組相比顯著下降（P<0.05）。模型組與對照