轉(zhuǎn)錄因子T-bet特異性shRNA的研制及其對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)研究.pdf

1、研究目的：探討T-bet基因在DBA/1小鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，及其作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療靶點(diǎn)的可能性。
　　 研究方法：
　　 (1)根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，應(yīng)用雞Ⅱ型膠原誘導(dǎo)DBA/1小鼠，建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型。
　　 (2)構(gòu)建小鼠T-bet基因特異性的shRNA真核干擾載體和針對(duì)無(wú)意義序列的對(duì)照質(zhì)粒；通過(guò)將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC2.4細(xì)胞，分析其功能。
　　 (3)以表達(dá)T-be

2、t基因的真核質(zhì)粒及T-bet特異性真核干擾質(zhì)粒進(jìn)行關(guān)節(jié)局部干預(yù)，觀察各組小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病時(shí)間及成模小鼠的行為改變，并收集各組小鼠關(guān)節(jié)、脾臟和腹股溝淋巴結(jié)。
　　 (4)對(duì)病變關(guān)節(jié)行HE染色及免疫組化染色，觀察關(guān)節(jié)局部滑膜炎癥損傷程度及T-bet表達(dá)情況。
　　 (5)應(yīng)用熒光定量PCR法，檢測(cè)病變關(guān)節(jié)滑膜、脾臟及淋巴結(jié)T-bet和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)成功建立了雞Ⅱ型膠原誘

3、導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型，小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率為100％，平均發(fā)病時(shí)間為35±5天，關(guān)節(jié)炎癥得分為10±2分。
　　 (2)成功構(gòu)建了針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子T-bet的特異性真核干擾質(zhì)粒及針對(duì)無(wú)意義序列的對(duì)照質(zhì)粒。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染有T-bet真核干擾質(zhì)粒的DC2.4細(xì)胞研究表明，與對(duì)照組相比，T-bet mRNA及蛋白的表達(dá)水平均明顯降低，同時(shí)DC2.4細(xì)胞表達(dá)IFN-γ水平亦明顯降低。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析顯示，轉(zhuǎn)有真核干擾質(zhì)粒的DC2.4細(xì)胞，其表面CD

4、80、CD86和MHCⅡ類分子均呈現(xiàn)明顯下調(diào)。提示，本試驗(yàn)構(gòu)建的針對(duì)T-bet基因的真核干擾質(zhì)粒，能夠有效地抑制T-bet基因的表達(dá)，同時(shí)相關(guān)細(xì)胞因子和表面分子的表達(dá)水平也發(fā)生了相應(yīng)的改變。
　　 (3)膠原誘導(dǎo)性小鼠關(guān)節(jié)炎模型鼠的關(guān)節(jié)局部干預(yù)研究表明，在T-bet質(zhì)粒干預(yù)小鼠，其關(guān)節(jié)局部可因T-bet基因的高表達(dá)而明顯促進(jìn)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，發(fā)病率為100％，且發(fā)病時(shí)間提前，一般在誘模的第22天左右發(fā)病，平均發(fā)病時(shí)間為23±2天，關(guān)

5、節(jié)平均炎癥評(píng)分3.5±O.5分；在T-bet干擾質(zhì)粒干預(yù)的小鼠，其關(guān)節(jié)發(fā)病率僅為20％，平均發(fā)病時(shí)間延長(zhǎng)為40±5天，炎癥評(píng)分1±0.5分。
　　 結(jié)論：
　　 T-bet是Th1細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在初始T細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用。本試驗(yàn)構(gòu)建了T-bet特異性真核干擾質(zhì)粒；經(jīng)轉(zhuǎn)染樹(shù)突狀細(xì)胞系表明，其對(duì)T-bet及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)具有明顯的抑制作用；膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型局部應(yīng)用的干預(yù)研究