薯蕷皂苷對大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、自身免疫性疾病，其主要病理特點是滑膜細(xì)胞增生，襯里層增厚，多種炎性細(xì)胞浸潤，血管翳形成，繼而引起軟骨和骨組織的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。目前治療RA的藥物可分為非甾體抗炎藥、甾體抗炎藥和慢作用抗風(fēng)濕藥。由于RA的病因和發(fā)病機(jī)制仍不甚明了，臨床應(yīng)用受到限制。尋找安全、有效、毒副作用小的治療RA的中藥是今后研究的重要方向之一。中藥穿山龍(Dioscor

2、ea nipponica Makino)，主要成分有穿山龍含薯蕷皂甙(dioscin)，纖細(xì)薯蕷皂甙（gracillin），穗菝葜甾甙(asperin)，25-D-螺甾-3，5-二烯（25-D-spirosta-3，5-diene）及對羥基芐基酒石酸(piscidic acid)。中醫(yī)作藥物為其根莖，有舒筋活絡(luò)，祛風(fēng)止痛之功效。大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)是兼有體液免疫和細(xì)胞免疫變

3、化的慢性系統(tǒng)性免疫性炎癥，與RA有許多共同的組織學(xué)和免疫學(xué)特征，是篩選和研究治療RA藥物的較理想模型。本課題在建立大鼠CIA模型的基礎(chǔ)上，從整體、器官、細(xì)胞、分子、信使RNA基因表達(dá)等不同層次研究了Dioscin對CIA大鼠的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，并對其部分機(jī)制進(jìn)行了探討，為開發(fā)和利用穿山龍資源，提供理論依據(jù)。
　　1 Dioscin體內(nèi)給藥對大鼠CIA炎癥和免疫反應(yīng)的影響
　　應(yīng)用異源性雞Ⅱ型膠原(CCⅡ)和弗氏不完全佐劑(

4、FIA)建立大鼠CIA模型，用足爪儀測量足爪腫脹度(△ml)，同時采用O-4級評分法進(jìn)行關(guān)節(jié)評分;檢測體重變化情況(△g);測定大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù);用ELISA法檢測CIA大鼠抗CCⅡ抗體;用螺旋測微計測量兩耳厚度之差(△mm)觀察CIA大鼠對CCⅡ的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng);用H&E染色的方法觀察病理組織學(xué)改變;結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIA大鼠炎癥和免疫反應(yīng)表現(xiàn)為足爪腫脹和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎;體重和免疫器官（胸腺和脾）減輕;體內(nèi)產(chǎn)生抗CⅡ抗體和對CCⅡ的遲發(fā)型變

5、態(tài)反應(yīng);其病理組織學(xué)顯示炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增厚、關(guān)節(jié)軟骨破壞，與人RA類似，Dioscin30、60、120mg·kg-1，(ig)×7d均能明顯減輕CIA大鼠足爪腫脹和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，緩解體重和免疫器官（胸腺和脾）重量的異常變化;對CIA大鼠抗CCⅡ抗體無明顯作用;可顯著抑制CIA大鼠的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng); Dioscin可明顯減輕異常的病理組織學(xué)變化，對CIA大鼠病變關(guān)節(jié)的病理組織結(jié)構(gòu)有明顯的改善作用。
　　2 Dioscin體內(nèi)、

6、體外給藥對CIA大鼠免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的作用
　　采用MTT法檢測胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng);用活化的小鼠脾淋巴細(xì)胞MTT比色法檢測胸腺淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2的活性;采用ConA誘導(dǎo)的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞MTT參入法檢測腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1的水平;采用生物學(xué)方法檢測腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α的活性;結(jié)果表明CIA大鼠ConA誘導(dǎo)的胸腺T細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的產(chǎn)生顯著增高，LPS誘導(dǎo)的脾B細(xì)胞增殖反應(yīng)無明顯變化;腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生

7、的IL-1和TNF-α的活性明顯升高。Dioscin30、60、120mg·kg-1,(ig)×7d和體外0.5、2.5、12.5、62.5、125mg·L-1不同濃度可抑制CIA大鼠過高的胸腺T細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的產(chǎn)生;對于腹腔巨噬細(xì)胞IL-1、TNF-α的過度產(chǎn)生也有抑制作用。
　　3Dioscin體內(nèi)、體外給藥對CIA大鼠滑膜細(xì)胞增殖及其分泌功能的影響
　　RA早期的病變位于滑膜，其滑膜細(xì)胞功能的改變直接影響RA病

8、理進(jìn)程。原代培養(yǎng)細(xì)胞離體時間短，其生物學(xué)特性和遺傳性基本與體內(nèi)相似，無自發(fā)性變異，是細(xì)胞形態(tài)、機(jī)能、分化等研究的理想材料。本文采用MTT法檢測滑膜細(xì)胞的增殖反應(yīng):采用ConA誘導(dǎo)的小鼠胸腺淋巴細(xì)胞MTT參入法檢測滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1的水平;采用生物學(xué)方法檢測滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α的活性;結(jié)果表明CIA大鼠滑膜細(xì)胞的增殖反應(yīng)升高;滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1和TNF-α的活性明顯升高。Dioscin30、60、120mg·kg1，(ig)×

9、7d和體外0.5、2.5、12.5、62.5、125mg·L-1不同濃度可抑制CIA大鼠過高的滑膜細(xì)胞的增殖反應(yīng);對于滑膜細(xì)胞IL-1、TNF-α的過度產(chǎn)生也有抑制作用。
　　4 Dioscin對膠原誘導(dǎo)性大鼠關(guān)節(jié)炎踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κ Bp65亞基和COX-2表達(dá)的影響
　　為了探討Dioscin對CIA大鼠炎癥免疫反應(yīng)的作用及其機(jī)制，本研究采用Western-blog方法檢測CIA大鼠滑膜組織中NF-κ Bp65亞基

10、和COX-2的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，CIA大鼠滑膜細(xì)胞的NF-κ Bp65亞基和COX-2的表達(dá)水平明顯高于正常對照組，Dioscin120mg·kg1能顯著降低關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κ Bp65亞基和COX-2表達(dá)(P＜0.01)，Dioscin(60mg/kg)和吲哚美辛亦可降低COX-2表達(dá)(P＜0.05)。提示:GCS通過抑制NF-κ Bp65亞基和COX-2表達(dá)，從而抑制滑膜細(xì)胞的增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的分泌而發(fā)揮抗