大體積工程化脂肪組織構(gòu)建條件的比較研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 臨床上因先天性畸形、外傷及腫瘤切除術(shù)等各種原因造成的大體積軟組織缺損一直是整形修復(fù)外科面臨的重大挑戰(zhàn)之一。2011年美國有近5百萬例的修復(fù)重建手術(shù)，78％為修復(fù)重建腫瘤切除術(shù)后的軟組織缺損。全球范圍內(nèi)每年大約有130萬乳腺癌新病例，乳癌切除后必將造成大范圍的軟組織缺損。手術(shù)治療這類軟組織缺損的目的不僅僅是為了填充凹陷，更重要的是要形成具有自然外觀和美學(xué)功能、與身體周圍組織結(jié)合并長期維持穩(wěn)定的自然組織。

2、r>　　 傳統(tǒng)的乳房再造的手術(shù)方案多采用自體皮瓣或脂肪瓣轉(zhuǎn)移修復(fù)。術(shù)后都不可避免地造成供區(qū)不可逆的畸形與疤痕。因此能夠構(gòu)建定形狀、定體積、可供移植的軟組織瓣成為了臨床醫(yī)師的“終極夢想”。
　　 脂肪組織工程技術(shù)為解決軟組織缺損的修復(fù)提出了全新的思路。1999年P(guān)atrick利用前脂肪細(xì)胞在聚乳酸乙醇酸材料上成功構(gòu)建出脂肪組織，通過將特異性種子細(xì)胞種植于生物活性支架材料上，通過種子細(xì)胞和材料的相互作用促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，首先實

3、現(xiàn)了在體內(nèi)外構(gòu)建工程化脂肪組織的嘗試。但直至近期的報道，不管是通過優(yōu)化種子細(xì)胞或者改性生物活性材料或者改善局部微環(huán)境，最終構(gòu)建的工程化脂肪組織，其體積都沒有超過1ml，并且在組織構(gòu)成和組織穩(wěn)定上都難以達(dá)到滿意的結(jié)果。
　　 隨著深入的研究，目前認(rèn)為組織工程化脂肪組織的體積主要取決于:①構(gòu)建物早期的快速血管化，這是限制組織工程技術(shù)最終構(gòu)建物體積以及組織結(jié)構(gòu)成熟的關(guān)鍵因素;②可隨構(gòu)建物動態(tài)發(fā)展、可控降解、組織相容性良好的生物材料;③

4、符合構(gòu)建物發(fā)生發(fā)展的生長因子梯度及微環(huán)境;④穩(wěn)定的物理屏障以保障構(gòu)建物體積和組織形態(tài)的長期穩(wěn)定。
　　 對于如何促進(jìn)早期構(gòu)建組織的血管化這個關(guān)鍵問題，許多學(xué)者提出不同的實驗方案，如局部加入促血管生長因子（VEGF、FGF、HGF等），病毒載體轉(zhuǎn)染促血管生成基因，不同種子細(xì)胞共培養(yǎng)等，以使早期構(gòu)建物盡快血管化;通過直接添加或者緩釋技術(shù)等添加各種生長因子，但是目前為止都未能明顯改善最終構(gòu)建物的體積。
　　 針對這些關(guān)鍵因素，

5、Hofer等人于2003年提出“組織工程室技術(shù)(TissueChamber Technique)”的概念，即采用生物惰性材料制作有一定硬度的保護(hù)性容器，將軸形血管或不同組織轉(zhuǎn)移到其內(nèi)部，為擬構(gòu)建的組織提供血運基礎(chǔ)、營養(yǎng)物質(zhì)和生長所需空間，稱為血管化組織工程室。這種創(chuàng)新型的構(gòu)建模式思路為我們的組織工程研究大大拓寬了道路，通過引入在體的血管蒂，使移植物能夠在早期獲得充足的血供和營養(yǎng)，極大提高種子細(xì)胞的存活率。局限性的工程室能夠?qū)⒅С纸M織新生

6、相關(guān)的生長因子限制在工程室室內(nèi)，并隨著組織的動態(tài)發(fā)展提供相應(yīng)的變化，同時硬性的工程室外殼為新生物提供堅固的物理支撐，保障構(gòu)建物的生長。這種新型的構(gòu)建模式似乎相應(yīng)地解決了傳統(tǒng)組織工程化組織的體積大小受限的幾個關(guān)鍵問題。
　　 但是脂肪組織本身具有很獨特的生理結(jié)構(gòu)，脂肪組織中除了豐富的血管網(wǎng)絡(luò)之外，90％的空間由高耗氧、高耗能的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，同時作為機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官，脂肪組織能分泌多種脂肪因子，同時參與血管化和脂肪化的過程，單純

7、促進(jìn)血管化能否構(gòu)建出完整成熟的脂肪組織？脂肪組織內(nèi)和脂肪組織周圍的局部微環(huán)境是否影響最終新生構(gòu)建物的組織形態(tài)和成熟程度？如何協(xié)調(diào)地促進(jìn)血管化和脂肪化的相互作用？歸根結(jié)底來說，就是如何利用組織工程室模型，闡明工程室內(nèi)各種微環(huán)境對新生組織的影響，最終誘導(dǎo)大體積成熟工程化脂肪組織。
　　 圍繞這幾個科學(xué)問題，本實驗先是研究了利用組織工程室模型和預(yù)構(gòu)技術(shù)，通過加強(qiáng)早期血管化，觀察外源性種子細(xì)胞在新生組織中的功能和最終的組織結(jié)構(gòu)，探討通過

8、單純促進(jìn)血管化策略是否能構(gòu)建出大體積的新生組織。而后通過對組織工程室內(nèi)單純成脂微環(huán)境和內(nèi)環(huán)境的對比，揭示局部微環(huán)境對于構(gòu)建大體積新生組織的影響。最后在工程室內(nèi)植入帶有軸形血管蒂的脂肪瓣誘導(dǎo)新生組織，探討利用自體組織脂肪再生的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、預(yù)構(gòu)富血管工程化組織構(gòu)建大體積新生組織的設(shè)想及實驗證實
　　 通過利用組織工程室模型和預(yù)構(gòu)技術(shù)，先構(gòu)建出富血管化的支架載體，然后加入標(biāo)記后脂肪組織特異性種子

9、細(xì)胞SVF，通過觀察新生組織的體積大小、組織形態(tài)、對種子細(xì)胞的功能進(jìn)行評價，探討促進(jìn)局部血管化對于構(gòu)建大體積新生組織的可能性。
　　 2、組織工程室內(nèi)內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)大體積脂肪組織新生
　　 利用組織工程室模型，通過在對工程室內(nèi)內(nèi)環(huán)境的檢測，觀察組織學(xué)形態(tài)、新生細(xì)胞來源、室內(nèi)內(nèi)環(huán)境動態(tài)變化，探討室內(nèi)局部內(nèi)環(huán)境對于新生構(gòu)建工程化組織的影響，證實單純成脂微環(huán)境和局部內(nèi)環(huán)境對大體積脂肪組織的誘導(dǎo)作用。
　　 3、組織工程室誘

10、導(dǎo)大體積脂肪組織新生的構(gòu)建策略
　　 將帶有軸形血管蒂的脂肪瓣植入組織工程室內(nèi)，不加入外源性種子細(xì)胞和生物支架，利用脂肪瓣內(nèi)成熟的血管化和脂肪化，通過在工程室內(nèi)同時提供血管化和成脂化的微環(huán)境，進(jìn)行大體積脂肪組織的新生誘導(dǎo)，并通過連續(xù)時間點的組織學(xué)觀察和相關(guān)因子檢測初步探討工程室誘導(dǎo)脂肪組織新生的相關(guān)機(jī)制。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

11、兩組之間比較采用配對t檢驗;不同時間點的差異采用協(xié)方差分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、利用組織工程室和單純血管蒂能夠誘導(dǎo)出大于1ml的以富血管化纖維結(jié)締組織為主的新生組織，加入脂肪組織特異性外源性種子細(xì)胞，成功構(gòu)建出1.1ml的新生組織，組織結(jié)構(gòu)主要是纖維結(jié)締組織，可見大量新生血管，但未見到明顯脂肪組織結(jié)構(gòu)。
　　 2、在工程室內(nèi)單純添加成脂誘導(dǎo)環(huán)境，最終形成的新生組織以纖維結(jié)締組織為主，未見明顯血管形成。不添加

12、任何外源性干預(yù)因素的情況下，利用組織工程室，發(fā)現(xiàn)術(shù)后兩個月，小室內(nèi)可見明顯組織新生形成凸起，組織學(xué)染色證實為成熟脂肪組織。室內(nèi)組織液中細(xì)胞數(shù)目15天為最高，45天至60天趨于穩(wěn)定，VEGF及MCP-1水平隨時間變化逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定，各時間點之間不存在顯著性性差異。在血管周發(fā)現(xiàn)CD34和圍脂滴蛋白雙陽性細(xì)胞，提示有間充質(zhì)干細(xì)胞在室內(nèi)進(jìn)行分化成熟。但是最后形成的新生組織體積小并且局限于包膜內(nèi)。
　　 3、在工程室內(nèi)植入帶有軸形

13、血管蒂的脂肪瓣，4周后成功構(gòu)建出3.03ml新生組織，組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)新生組織最外側(cè)可見一薄層纖維包膜，較為致密，厚度均一，原生組織與新生組織未見明顯區(qū)別，整個組織可見大量單房脂肪細(xì)胞聚集成團(tuán)，纖維束將其分割成大量小葉樣組織，中間可見大量血管分布，管腔中央有紅細(xì)胞提示為成熟通暢血管。新生構(gòu)建物同正常脂肪組織脂肪小葉結(jié)構(gòu)相似。通過連續(xù)時間點觀察發(fā)現(xiàn)新生組織存在動態(tài)變化的重塑過程。早期主要以大量單房脂肪細(xì)胞增生、自組裝纖維蛋白原基質(zhì)的沉積以及

14、炎性反應(yīng)為主，并不伴有血管的長入。而后出現(xiàn)血管長入，后期主要是新生組織中脂肪細(xì)胞、血管和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行動態(tài)重塑，最終形成具有標(biāo)志性脂肪小葉的成熟脂肪組織。
　　 討論：
　　 目前臨床上修復(fù)大體積軟組織缺損主要是自體皮瓣和脂肪瓣轉(zhuǎn)移法，術(shù)后都不可避免地造成供區(qū)不可逆的畸形與疤痕。利用傳統(tǒng)的組織工程三要素很難獲得大體積成熟脂肪組織，關(guān)鍵在于誘導(dǎo)過程中不能滿足血管化和脂肪化的協(xié)調(diào)發(fā)展，早期血供的延遲成為構(gòu)建大體積工程化脂肪組

15、織的瓶頸。2003年“組織工程室”概念的提出為解決這個問題提供了新的視角。
　　 組織工程室可以在早期通過組織創(chuàng)傷釋放的生長因子作用下由在體血管蒂迅速促進(jìn)新生血管網(wǎng)的成熟;并且在室內(nèi)局部富集生長因子和細(xì)胞因子，為室內(nèi)內(nèi)容物的生長提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境;具有一定硬度的工程室能夠為室內(nèi)容物的生長提供穩(wěn)定的物理支撐，改變新生組織所處的力學(xué)環(huán)境，為大體積脂肪組織的誘導(dǎo)新生提供了可行的思路。
　　 但是鑒于脂肪組織結(jié)構(gòu)的特殊性，組織工程

16、室模型中真正能影響大體積成熟脂肪組織構(gòu)建的決定因素至今尚不清楚，這樣影響了大體積工程化脂肪組織的構(gòu)建策略。脂肪組織的增長需要豐富的血管網(wǎng)絡(luò)和局部成脂微環(huán)境的同時存在，這是間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分化的必要條件，只有是血管化和成脂化相互協(xié)調(diào)發(fā)展，才能最終保證大體積成熟脂肪組織的構(gòu)建成功。
　　 通過我們的實驗，將單純血管束植入工程室內(nèi)，最終能得到了大于1ml的富血管化新生組織，但其組織類型主要以纖維結(jié)締組織為主。在這個室內(nèi)富血管床中添加脂

17、肪組織特有的SVF細(xì)胞，最終形成的新生組織可見大量的血管，但是結(jié)構(gòu)依然為纖維結(jié)締組織，未見到明顯實質(zhì)組織結(jié)構(gòu)?？梢娫谌鄙傧鄳?yīng)成脂微環(huán)境的誘導(dǎo)，即使特異性的外源性干細(xì)胞能在早期獲得充足的血供，但由于微環(huán)境的缺乏依然不能自主分化形成脂肪細(xì)胞，導(dǎo)致難以對工程化組織的組織形態(tài)實現(xiàn)定向控制，不能構(gòu)建出大體積的新生脂肪組織。單純在室內(nèi)加入脂肪組織塊作為成脂微環(huán)境，最終因為缺少血液的供應(yīng)，新生組織依然為纖維結(jié)締組織并缺少血管長入。通過室內(nèi)內(nèi)環(huán)境的連續(xù)

18、觀察，我們發(fā)現(xiàn)工程室內(nèi)早期的組織滲出液中含有大量的生長因子和細(xì)胞成分，這些細(xì)胞主要分布于血管周圍并且表達(dá)CD34和圍脂滴蛋白雙陽性，提示這些細(xì)胞可能來源于循環(huán)中的間充質(zhì)干細(xì)胞成分，最終形成的脂肪細(xì)胞可能就是這些間充質(zhì)干細(xì)胞在包膜內(nèi)的成脂環(huán)境誘導(dǎo)下增殖分化而來。但是這中新生的組織遠(yuǎn)遠(yuǎn)體積較小，限制在包膜內(nèi)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到臨床上的要求?？梢娫谌鄙俪裳芎统芍T導(dǎo)下，單純依靠室內(nèi)內(nèi)環(huán)境，最終難以形成大體積可供移植的脂肪組織。
　　 通過在

19、工程室內(nèi)植入帶有軸形血管蒂的脂肪瓣，同時成血管和成脂微環(huán)境完美結(jié)合，4周后即能得到3.03ml的成熟工程化脂肪組織，并且新生組織形狀同工程室形狀相似。通過連續(xù)時間點觀察發(fā)現(xiàn)新生組織存在動態(tài)變化的重塑過程。早期首先出現(xiàn)的是大量單房脂肪細(xì)胞在自組裝纖維蛋白原基質(zhì)上增殖、分化，這個過程并不伴有血管的長入。而后才出現(xiàn)血管長入，后期主要是新生組織中脂肪細(xì)胞、血管和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行動態(tài)重塑，最終形成具有標(biāo)志性脂肪小葉的成熟脂肪組織。這種大體積工程化脂

20、肪組織構(gòu)建策略的實現(xiàn)對于臨床上各種不同部位、不同形式的大體積軟組織缺損的修復(fù)提供了一種安全、穩(wěn)定且有效地新途徑。
　　 結(jié)論：
　　 1、單純通過促進(jìn)血管化，只能構(gòu)建出富血管化的纖維結(jié)締組織，并不能誘導(dǎo)種子細(xì)胞的定向成脂分化，不能誘導(dǎo)大體積的脂肪組織新生。
　　 2、在缺乏血管化和成脂化的工程室內(nèi)，難以短期形成大體積可供移植的脂肪組織，單純提供成脂環(huán)境不能形成富血管化的成熟脂肪組織。
　　 3、將帶有軸性