兔模型中定形狀的大體積工程化帶蒂脂肪瓣預(yù)構(gòu)：組織工程室兩步法.pdf

1、背景和目的：
　　臨床上，對(duì)于先天畸形、外傷、腫瘤切除造成的大體積軟組織缺損進(jìn)行修復(fù)一直以來都是整形外科醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)，這些缺損通常需要復(fù)雜的修復(fù)重建手術(shù)來治療。吻合血管的自體組織移植是目前最被廣泛接受和推薦的治療。然而，這種手術(shù)有很多技術(shù)上的挑戰(zhàn)，而且還不可避免地導(dǎo)致供區(qū)的缺損畸形。目前一個(gè)以解決軟組織缺損修復(fù)重建的新領(lǐng)域—脂肪組織工程技術(shù)，為自體組織瓣移植提供了另一種可能的選擇。2007年，研究人員將一個(gè)帶腹壁淺血管蒂的脂

2、肪瓣插入一個(gè)中空的小室中，再植入大鼠的腹股溝皮下，最終導(dǎo)致了腹股溝脂肪瓣的顯著增長。這種組織工程室(TEC)技術(shù)為組織工程領(lǐng)域提供了新的可能。
　　先前的研究已經(jīng)表明，TEC技術(shù)可以產(chǎn)生大量的脂肪組織。然而，在大動(dòng)物體內(nèi)長期的觀察表明，植入的脂肪瓣最終不能100％完全填滿工程室內(nèi)的所有空間，這就意味著工程化脂肪瓣的體積沒有最大化。我們之前關(guān)于大鼠的研究可能可以解釋這個(gè)現(xiàn)象，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)把TEC小室植入動(dòng)物體內(nèi)，新生的組織表面覆蓋了一

3、層厚厚的包膜囊。這個(gè)包膜囊可能降低了來自脂肪瓣周圍的灌注從面限制了脂肪瓣的進(jìn)一步增長。因此，我們推測(cè)包膜囊的形成可能是限制工程化組織瓣達(dá)到其最大體積的關(guān)鍵因素之一。另一方面，雖然該包膜囊可以限制脂肪瓣的體積增長，但是它也可以維持TEC所構(gòu)建脂肪瓣的外形。
　　據(jù)先前的報(bào)道所知，Morrison團(tuán)隊(duì)所構(gòu)建出的組織瓣大都是單一的半球形。然而面對(duì)臨床上的形形色色的缺損，我們不禁提出疑問:利用組織工程室技術(shù)能否構(gòu)建出不同形狀的脂肪瓣？如何

4、構(gòu)建接近臨床需求的更大體積的脂肪瓣？這些構(gòu)建出的工程化脂肪瓣的原位遠(yuǎn)期轉(zhuǎn)歸又如何呢？
　　基于以上的觀察，我們推測(cè)使用TEC可以實(shí)現(xiàn)脂肪瓣的形狀預(yù)構(gòu)。首先將脂肪瓣放入合適形狀的組織工程小室中，當(dāng)脂肪瓣體積穩(wěn)定后去除小室，可以促進(jìn)成形的脂肪瓣的進(jìn)一步生長。為了檢測(cè)這個(gè)“兩步法”技術(shù)，我們進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):運(yùn)用兔模型將帶蒂脂肪組織瓣置于不同形狀的小室中，并觀察在此過程中大體和組織學(xué)的變化。
　　方法：
　　1、組織工程室內(nèi)大

5、體積帶蒂脂肪組織瓣的形狀預(yù)構(gòu)
　　在兔背部皮下放置圓形與心形兩種形狀組織工程室，再將帶蒂脂肪瓣放入小室內(nèi)。在不同時(shí)間點(diǎn)（2周、4周、8周）觀察構(gòu)建物的體積、形狀、組織學(xué)等動(dòng)態(tài)變化的過程。
　　2、構(gòu)建物二次增長模式的研究
　　在利用組織工程室模型構(gòu)建穩(wěn)定的組織瓣后，將小室去除后，4周后再原位觀察構(gòu)建物的變化情況，通過體積測(cè)量、組織學(xué)的變化來探討二次增長模式的可行性。
　　3、組織工程室誘導(dǎo)的構(gòu)建物的原位長期轉(zhuǎn)歸的

6、觀察
　　利用組織工程室技術(shù)構(gòu)建成熟的脂肪組織瓣后，一側(cè)小室去除另一側(cè)小室保留，并分別觀察在小室內(nèi)的以及去除小室后的構(gòu)建物在不同時(shí)間點(diǎn)（16周、24周）的變化。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩組之間同一時(shí)間點(diǎn)比較采用Bonferroni's檢驗(yàn);同組不同時(shí)間點(diǎn)的差異采用協(xié)方差分析及post-hoc分析的T檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1、

7、不同形狀的組織工程室內(nèi)構(gòu)建物在2周時(shí)外形與小室吻合，但構(gòu)建物外周以膠樣物質(zhì)填充，脂肪瓣內(nèi)部組織學(xué)出現(xiàn)血管形成伴隨著脂肪新生，伴炎性細(xì)胞浸潤，外周以炎性細(xì)胞浸潤為主;4周時(shí)構(gòu)建物形狀與小室基本吻合，血管化及脂肪化趨于穩(wěn)定，4周-8周時(shí)外形無明顯變化但組織學(xué)表現(xiàn)為具有標(biāo)志性脂肪小葉結(jié)構(gòu)的成熟脂肪組織，表面被一以纖維結(jié)締組織成分為主的包膜包裹。
　　2、將小室去除后4周組織瓣體積再一次明顯的抬升，實(shí)現(xiàn)了二次增長。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)與室內(nèi)第一

8、次誘導(dǎo)新生相似，脂肪瓣內(nèi)部再次出現(xiàn)血管形成并伴隨著脂肪新生，可見炎性細(xì)胞浸潤，包膜厚度較室內(nèi)組織瓣變薄。全組織染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Lectin及Ki67陽性細(xì)胞均有增加進(jìn)一步提示脂肪瓣內(nèi)部再次出現(xiàn)血管化及細(xì)胞增殖。
　　3、去除小室后兩種不同形狀小室構(gòu)建物體積在16周時(shí)均有輕度增加，到24周達(dá)到穩(wěn)定，24周體積與16周相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩種不同形狀的組織瓣形狀仍能維持。一直在小室內(nèi)的構(gòu)建物體積在4周時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，一直持續(xù)至24周。

9、>　　討論：
　　臨床上修復(fù)大體積軟組織缺損常用的方法是皮瓣轉(zhuǎn)移或脂肪移植來進(jìn)行修復(fù)。皮瓣轉(zhuǎn)移手術(shù)塑形困難，供皮的繼發(fā)損傷較大，自體游離脂肪移植后吸收率高，且遠(yuǎn)期效果欠佳。在本實(shí)驗(yàn)中，我們展示的是一種在兔模型中不添加任何外源性的血管化或脂肪化的生長因子以及生物可降解的細(xì)胞外基質(zhì)支架，而成功構(gòu)建出與組織工程室形狀吻合的大體積血管化脂肪瓣。
　　眾所周知，脂肪化分為兩個(gè)階段:間充質(zhì)干細(xì)胞先分化成脂肪前體細(xì)胞，再從脂肪前體細(xì)胞最終

10、分化成成熟脂肪細(xì)胞。在脂肪組織工程中，在細(xì)胞自身分泌ECM之前，需要合適的ECM來為細(xì)胞提供支撐，讓細(xì)胞粘附于ECM上進(jìn)行增殖和分化。所以，添加生長因子如成纖維細(xì)胞生長因子及胰島素樣生長因子被廣泛應(yīng)用于脂肪組織工程中來促進(jìn)脂肪化。目前，添加ECM及生長因子是否可以得到一個(gè)更好的構(gòu)建物仍需要進(jìn)一步的研究。
　　我們通過實(shí)驗(yàn)可以在2周時(shí)看到明顯脂肪化的證據(jù)，在8周時(shí)脂肪組織已逐漸成熟。在受到任何的創(chuàng)傷刺激時(shí)，各種各樣的細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的

11、信號(hào)通路會(huì)激活，它們共同作用去修復(fù)組織的完整性來維持生物體內(nèi)平衡。這個(gè)組織修復(fù)愈合的復(fù)雜過程基本存在于所有的組織內(nèi)當(dāng)然也包括脂肪組織。之前也有研究證明，由外科操作引起的創(chuàng)傷及炎癥是促進(jìn)組織工程室內(nèi)脂肪瓣成血管化及成脂化的關(guān)鍵因素之一。另外，脂肪瓣中細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸喪失及脂肪瓣所受到的機(jī)械力可以通過力傳導(dǎo)的方式來促進(jìn)小室內(nèi)組織的有絲分裂。綜上所述，以上的這些因素使得組織工程室內(nèi)的脂肪瓣在前8周迅速增長。
　　但是，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，

12、我們發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中，雖然圓形小室內(nèi)構(gòu)建物體積從0.8ml增長到了5.09ml，心形小室內(nèi)的體積也從0.8ml增至了3.65ml，但之后從8周到24周，體積上和組織學(xué)上都沒有了明顯的變化。很多證據(jù)表明當(dāng)生物體內(nèi)植入異物時(shí)，會(huì)引起特異的愈合反應(yīng)，這種愈合是有多種細(xì)胞信號(hào)參與的復(fù)雜炎癥反應(yīng)，通過把成纖維細(xì)胞遷移到植入物表面，接著成纖維細(xì)胞分化成表達(dá)SMA的肌成纖維細(xì)胞。這些肌成纖維細(xì)胞分泌膠原包膜來將異物與周圍的軟組織分開。這層厚包膜使得

13、細(xì)胞獲得細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸抑制從而限制脂肪瓣的生長，從而創(chuàng)傷愈合才趨于穩(wěn)定。所以，當(dāng)脂肪化與纖維化在8周達(dá)到平臺(tái)期時(shí)，脂肪瓣的體積才保持相對(duì)穩(wěn)定一直到24周。
　　令我們驚訝的是，當(dāng)我們?cè)?周時(shí)去除小室后，12周時(shí)發(fā)現(xiàn)脂肪瓣表面包膜變薄，脂肪瓣體積進(jìn)一步增加。圓形小室體積從5.09ml增至10.98ml，心形小室從3.65ml增至7.15ml。脂肪組織的再次生長可能是由于小室去除操作引起的創(chuàng)傷或炎癥環(huán)境的上調(diào)以及導(dǎo)致包膜的異物反應(yīng)

14、的下調(diào)。但同時(shí)，在12周到24周過程中，一旦皮下的空隙被新生組織填滿生長就會(huì)停止。然而，雖然包膜會(huì)限制脂肪瓣的生長，同時(shí)它在小室去除后的16周中，也有助于維持組織工程室構(gòu)建出來的脂肪瓣的形狀，提示特定形狀的脂肪瓣可以通過這種方法來構(gòu)建從而滿足臨床需要。更長時(shí)間的觀察還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
　　令我們好奇的是，我們還發(fā)現(xiàn)在空白對(duì)照組中，當(dāng)0周和8周進(jìn)行兩次假手術(shù)后，脂肪瓣中也發(fā)現(xiàn)許多血管化良好的間質(zhì)組織，但是最終沒有明顯的組織生長。很多

15、研究已經(jīng)報(bào)道機(jī)械力的改變可以促進(jìn)成血管化和生長因子的上調(diào)。Harunosuke Kato等也發(fā)現(xiàn)組織的外在懸浮可以通過激活現(xiàn)在的祖細(xì)胞來誘導(dǎo)脂肪組織的增大。因此，空白對(duì)照組脂肪瓣不增長可能是由于炎癥反應(yīng)后缺少機(jī)械力的作用，而短時(shí)間的創(chuàng)傷或炎癥環(huán)境還不足以誘導(dǎo)脂肪瓣的增長。
　　Findlay等利用脂肪組織工程模型在豬的體內(nèi)誘導(dǎo)出大體積的組織瓣，在他們的實(shí)驗(yàn)中，從工程化組織瓣上去除小室后，相對(duì)于動(dòng)物的增長速率而言反而減緩了脂肪瓣的生

16、長，而在我們的兔模型實(shí)驗(yàn)中，去除小室后組織卻再次快速生長。這種不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由于兩種不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物導(dǎo)致的。豬不像兔子一樣體重比較恒定，豬的體重會(huì)增長，所以可能會(huì)在此實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生混雜的影響。其次，我們的組織工程室植入的兔背部皮下，兔的皮膚質(zhì)地比豬的腹股溝皮膚要疏松很多。所以，當(dāng)去除小室后，被小室擴(kuò)張的皮膚及周圍組織只對(duì)構(gòu)建物產(chǎn)生比較輕的壓力，使得脂肪瓣能進(jìn)一步增長。這就意味著當(dāng)皮下有充足的空間以及小室去除后的小壓力很可能讓脂肪瓣繼續(xù)增

17、長，然而，本研究結(jié)果還是應(yīng)該在其它動(dòng)物模型中進(jìn)一步證實(shí)。
　　這是繼澳大利亞實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)構(gòu)建出大體積軟組織瓣后首次探討定形狀脂肪組織瓣的研究，同時(shí)提出了組織工程室技術(shù)二次增長模式的概念，也做了較長時(shí)間的穩(wěn)定性觀察，對(duì)于將來組織工程室技術(shù)誘導(dǎo)大體積軟組織再生應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。盡管組織工程室技術(shù)的構(gòu)建方案尚不完全成熟，構(gòu)建物形狀尚不能精確的預(yù)構(gòu)，但其組織學(xué)為以成熟脂肪結(jié)構(gòu)為主的軟組織瓣，遠(yuǎn)期穩(wěn)定性值得肯定，因此這種大體積工程化脂肪

18、組織構(gòu)建策略對(duì)于臨床上各種部位、不同形狀的大體積軟組織缺損的修復(fù)，可以在體內(nèi)由小到大預(yù)構(gòu)出定形狀的帶血管蒂的脂肪瓣，像皮膚擴(kuò)張器一樣先擴(kuò)張后移植，避免傳統(tǒng)的切除脂肪瓣后造成的繼發(fā)供區(qū)畸形，不失為一種安全、穩(wěn)定、有效的新途徑。
　　結(jié)論：
　　1、運(yùn)用組織工程室技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同形狀大體積帶蒂脂肪瓣的預(yù)構(gòu)。
　　2、通過去除工程室原位可誘導(dǎo)脂肪瓣的體積二次增長，實(shí)現(xiàn)更大體積脂肪瓣的構(gòu)建。
　　3、利用組織工程室技術(shù)構(gòu)