脂肪干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化角膜基質(zhì)的實驗研究.pdf

1、目的：探討兔脂肪干細(xì)胞（rabbit adipose-derived stem cells，rASCs）的生物學(xué)特性及其復(fù)合多孔支架材料聚羥基乙醇(PLGA)的生物相容性。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討以自體、異體rASCs 作為種子細(xì)胞分別復(fù)合PLGA 支架材料構(gòu)建組織工程角膜基質(zhì)修復(fù)角膜基質(zhì)層缺損的可行性，評價其修復(fù)效果并探討作用機制，為角膜組織工程種子細(xì)胞和生物支架材料的研究提供實驗依據(jù)。
　　 方法：（1）采用消化法分離培養(yǎng)兔脂

2、肪干細(xì)胞，傳至第四代驗證其多向分化功能。（2）熒光染料DiO 標(biāo)記第四代脂肪干細(xì)胞并將其接種于多孔PLGA 支架，hoechst 法定量檢測細(xì)胞在支架上的生長情況，并分別于接種后第1，3，7 天對細(xì)胞-生物材料復(fù)合物行共聚焦顯微鏡和掃描電鏡檢測，觀察細(xì)胞在該支架上的粘附生長和細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。（3）腺病毒轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（green fluoresence protein, GFP）標(biāo)記兔脂肪干細(xì)胞，示蹤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)歸。構(gòu)建兔角膜基質(zhì)

3、缺損模型，自體和異體rASCs-PLGA 復(fù)合物體外培養(yǎng)7 天后分別回植到相應(yīng)角膜基質(zhì)缺損模型的角膜基質(zhì)層間，術(shù)后第12 周和24 周取材行大體觀、組織學(xué)和透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察比較修復(fù)效果。單純?nèi)睋p不加移植物組和未接種細(xì)胞的PLGA 材料移植組作為對照組。（4）熒光顯微鏡檢測自體和異體rASCs-PLGA 組角膜基質(zhì)層間GFP 的表達(dá)，免疫熒光檢測相應(yīng)部位角膜基質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白多糖keratocan 和胞漿蛋白ALDH1A1 的表達(dá)。<

4、br>　　 結(jié)果：（1）體外培養(yǎng)的第四代rASCs 具有成骨，成脂，成軟骨等多向分化功能。（2）細(xì)胞接種至PLGA 支架材料上增殖明顯，第7 天細(xì)胞生長達(dá)到平臺期，掃描電鏡和共聚焦顯微鏡檢測顯示細(xì)胞在支架上貼附生長良好，能夠在支架表面及孔隙內(nèi)壁得到充分伸展和生長，細(xì)胞外基質(zhì)分泌旺盛。（3）體內(nèi)實驗中自體rASCs-PLGA 組移植術(shù)后12 周材料降解，角膜基本恢復(fù)透明，異體rASCs-PLGA 組術(shù)后24 周仍未恢復(fù)透明。組織學(xué)檢查顯

5、示移植術(shù)后24 周自體rASCs-PLGA 組新生角膜基質(zhì)樣組織與正常角膜基質(zhì)組織相似，異體rASCs-PLGA 組仍有明顯缺損區(qū)域存在。電鏡下膠原纖維直徑比較顯示，各組術(shù)后24 周膠原直徑均較12 周時均一、排列也趨于整齊，自體rASCs-PLGA 組角膜基質(zhì)膠原直徑纖維排列與正常角膜基質(zhì)最為相似，異體組次之。（4）熒光顯微鏡下可見自體rASCs-PLGA 組和異體rASCs-PLGA組角膜基質(zhì)層間均有GFP陽性細(xì)胞表達(dá)，自體組多于異

6、體組。免疫熒光檢測顯示自體和異體組植入的細(xì)胞表達(dá)角膜基質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白多糖keratocan 和胞漿蛋白ALDH1A1。
　　 結(jié)論：體外培養(yǎng)的兔脂肪干細(xì)胞具有多向分化功能，與多孔PLGA支架具有良好的生物相容性，作為種子細(xì)胞來源可以構(gòu)建出具有良好組織學(xué)結(jié)構(gòu)的組織工程角膜基質(zhì)用以修復(fù)角膜基質(zhì)缺損，且自體細(xì)胞修復(fù)效果優(yōu)于異體細(xì)胞。植入脂肪干細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境誘導(dǎo)下向角膜基質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，為脂肪干細(xì)胞多向分化功能提供了新的實驗依據(jù)。<