MLL修飾H3K4me3在鋁致認(rèn)知功能障礙中的作用.pdf

1、目的：通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探討三甲基化的組蛋白H3第4位賴氨酸K4（H3K4me3）及其甲基轉(zhuǎn)移酶MLL改變?cè)阡X致認(rèn)知功能障礙中的作用。
　　方法：
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：160只無(wú)特定病原體級(jí)健康雄性SD大鼠按體重隨機(jī)分為4批16組，每組10只，每批設(shè)對(duì)照組及低、中、高劑量鋁暴露組，采用飲水方式染毒，對(duì)照組給予飲用自來(lái)水，染鋁組每日分別給予劑量為2 mg/kg、12 mg/kg、72 mg/kg體重的AlCl3染毒，第一批連續(xù)染毒9

2、0天，第二批染毒180天，第三批染毒270天，第四批染毒360天。染毒結(jié)束后，采用曠場(chǎng)試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)定大鼠的自主活動(dòng)、探索活動(dòng)和空間學(xué)習(xí)記憶能力，采用組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性/抑制性試劑盒測(cè)定海馬組織MLL酶活性，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定海馬組織H3K4me3蛋白表達(dá)量。
　　體外實(shí)驗(yàn)：選取同批次處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SH-SY5Y細(xì)胞，將其分為空白對(duì)照組、1mM Al3+、2mM Al3+、4mM Al3+組

3、，對(duì)照組不給予任何干預(yù)物，染鋁組給予相應(yīng)劑量的AlCl3，染毒48小時(shí)后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率，采用組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性/抑制性試劑盒測(cè)定MLL酶活性，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT–PCR）測(cè)定MLL相對(duì)表達(dá)量，采用免疫熒光化學(xué)法測(cè)定 MLL蛋白相對(duì)表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定H3K4me3蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　曠場(chǎng)試驗(yàn)

4、結(jié)果：（1）中央象限停留時(shí)間中央象限停留時(shí)間染鋁劑量與染鋁時(shí)間存在交互作用，其在染毒270天及360天時(shí)隨染鋁劑量的增高而延長(zhǎng)，各劑量組中央象限停留時(shí)間隨染鋁時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，多重線性回歸分析得回歸方程 Y=-10.211+0.234X1+4.558X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。（2）站立次數(shù)站立次數(shù)的染鋁劑量與染鋁時(shí)間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大鼠站立次數(shù)隨染鋁劑量的增高和染鋁時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，一般線性回歸分析得站立次數(shù)與染鋁

5、劑量和染鋁時(shí)間的回歸方程分別為Y=21.525-0.095X1、Y=35.004-2.145X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。（3）修飾次數(shù)大鼠修飾次數(shù)染鋁劑量與染鋁時(shí)間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大鼠修飾次數(shù)隨染鋁劑量的增高和染鋁時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，一般線性回歸分析得回歸方程分別為Y=-10.899-0.053X1、Y=-18.105-1.154X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。
　　Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果：（1）定位

6、航行試驗(yàn)逃避潛伏期大鼠逃避潛伏期染鋁劑量與染鋁時(shí)間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大鼠逃避潛伏期隨染鋁劑量的增高和染鋁時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，一般線性回歸分析得回歸方程分別為Y=-35.464+0.148 X1、Y=-26.075+1.738 X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。（2）空間探索試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限停留時(shí)間大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間染鋁劑量與染鋁時(shí)間存在交互作用，各染毒階段目標(biāo)象限停留時(shí)間隨染鋁劑量的增高而降低，低、中、高劑量組隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)目標(biāo)

7、象限停留時(shí)間減少，多重線性回歸分析得 Y=25.002-0.098X1-0.723X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。（3）空間探索試驗(yàn)穿越平臺(tái)位置次數(shù)大鼠穿越平臺(tái)位置次數(shù)染鋁劑量與染鋁時(shí)間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且其隨染鋁劑量的增高和染鋁時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，一般線性回歸分析得Y=-4.134-0.023X1、Y=-4.583-0.130X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。
　　大鼠海馬組織MLL酶活性測(cè)定結(jié)果：大鼠海馬組織

8、MLL酶活性染鋁劑量和染鋁時(shí)間的交互作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MLL酶活性隨染鋁劑量的增高和染鋁時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，一般線性回歸分析得 Y=40.242-0.151X1、Y=47.735-1.432X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。
　　ELISA法測(cè)定大鼠海馬組織H3K4me3蛋白表達(dá)結(jié)果：大鼠海馬組織H3K4me3蛋白含量染鋁劑量與染鋁時(shí)間存在交互作用，且其在染毒270天及360天時(shí)隨染鋁劑量的增高而降低，低、中、高劑量組 H3K

9、4me3含量隨染鋁時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，多重線性回歸分析得 Y=29.376-0.095X1-1.212X2（X1：染鋁劑量，X2：染鋁時(shí)間）。
　　認(rèn)知能力試驗(yàn)指標(biāo)與MLL酶活性及H3K4me3含量相關(guān)性分析：曠場(chǎng)試驗(yàn)中央象限停留時(shí)間及水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期與海馬 MLL酶活性下降呈負(fù)相關(guān)，曠場(chǎng)試驗(yàn)大鼠站立次數(shù)、修飾次數(shù)及水迷宮試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)象限停留時(shí)間與 MLL酶活性下降呈正相關(guān)，各指標(biāo)與H3K4me3含量下降的相關(guān)性同MLL酶活性。

10、r>　　2.體外實(shí)驗(yàn)
　　CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力結(jié)果：SH-SY5Y細(xì)胞活力隨染鋁劑量的增高而降低。
　　流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡結(jié)果：隨染鋁劑量的增高細(xì)胞凋亡率增高。
　　細(xì)胞MLL酶活性測(cè)定結(jié)果：隨染鋁劑量的增高M(jìn)LL酶活性呈下降趨勢(shì)，一般線性回歸分析得 MLL酶活性與染鋁劑量的回歸方程為Y=100.34-20.605X。
　　qRT-PCR測(cè)定細(xì)胞MLL相對(duì)表達(dá)量結(jié)果：各組細(xì)胞MLL相對(duì)表達(dá)未見明顯差異。<

11、br>　　免疫熒光化學(xué)法測(cè)定MLL蛋白相對(duì)表達(dá)結(jié)果：MLL熒光強(qiáng)度隨染鋁劑量的增高而降低，一般線性回歸分析得 MLL熒光強(qiáng)度與染鋁劑量的回歸方程為Y=986.115-110.753X。
　　ELISA法測(cè)定細(xì)胞H3K4me3蛋白表達(dá)結(jié)果：H3K4me3蛋白含量隨染鋁劑量的增高而降低，一般線性回歸分析得 H3K4me3蛋白含量與染鋁劑量的回歸方程為Y=59.57-7.089X。
　　結(jié)論：
　　1.慢性鋁暴露可致大鼠探索