山藥種質資源的離體保存及DNA指紋圖譜的構建.pdf

1、山藥(Dioscorea opposita)為薯蕷科薯蕷屬植物,是世界上重要的藥源植物和蔬菜作物。我國是山藥的主要發(fā)源地,在長期自然進化和人工栽培過程中,形成了很多具有重要價值的類型或品種,保存這些山藥類型或品種對我國乃至世界山藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義。傳統(tǒng)的山藥種質資源保存方法是田間種植保存,需要占用大量耕地、耗費大量的人力,同時由于病蟲害、自然災害等因為,使我國山藥種質資源的保存受到嚴重威脅,一些珍貴的山藥種質資源瀕臨滅

2、絕或已經(jīng)流失。針對山藥種質資源所面臨的問題,我們開展了山藥種質資源離體保存及DNA指紋圖譜構建的研究。主要研究結果如下:
　　 1、建立了山藥離體繁殖體系。試管苗可通過叢生芽、帶芽節(jié)段和微型塊莖3條途徑進行繁殖,其中帶芽節(jié)段途徑最有利于山藥試管苗的繁殖,在含有KT2.0mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1-0.2 mg·L-1+3％S的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),繁殖系數(shù)高,速度快。采用該培養(yǎng)基對不同基因型山藥的試管苗繼代培養(yǎng)達5年

3、,試管苗生長正常。形成的試管苗在KT2.0 mg·L-1+NAA0.02 mg·L-1+PP3330.5 mg·L-1-1 mg·L-1+3％S的MS培養(yǎng)基上生根早,生根率高,根系發(fā)達。
　　 2、建立了山藥微型塊莖誘導形成的“兩步液體培養(yǎng)法”模式。即將帶芽節(jié)段在液體繁殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后再轉入誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d形成微型塊莖。通過對微型塊莖誘導形成的影響因素研究,結果顯示蔗糖濃度、植物生長物質組合和光周期對其均有顯著影

4、響,以MS+KT0.5 mg·L-1+2,4-D0.1 mg·L-1+PP3330.1mg·L-1+6％S的組合、或轉入誘導培養(yǎng)基先暗處理2 d再光照14 h-d-1獲得的微型塊莖數(shù)量最多。
　　 3、建立了山藥試管苗緩慢生長的保存技術體系。研究了PP333、B9、甘露醇和活性炭在常溫和低溫下對試管苗保存效果的影響,結果顯示PP333結合低溫效果最好,鐵棍山藥、47號山藥和B號山藥三種基因型的最佳PP333濃度分別為5.0 mg

5、·L-1、2.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1,保存6個月后成活率分別為100％、100％和95％。
　　 4、建立了山藥試管苗帶芽節(jié)段分步冷凍法、玻璃化法和包埋玻璃化法超低溫保存技術體系。采用的帶芽節(jié)段均來自于室溫下培養(yǎng)60 d并于4℃鍛煉7 d的試管苗。分步冷凍法:將帶芽節(jié)段在MS+10％DMSO中預培養(yǎng)7 d,在10％DMSO+5％M+5％PVP的冰凍保護劑中,按照0℃2h→-20℃2h→-80℃2h程序逐級降溫后投

6、入液氮,保存后37℃水浴快速化凍,用MS+5％S的洗滌液洗滌4次,每次10 min;玻璃化法:將帶芽節(jié)段在MS+10％DMSO中預培養(yǎng)7 d,分別用60％和100％PVS1在0℃下過渡、脫水各60min,投入液氮,保存后37℃水浴快速化凍,用MS+7％S的洗滌液洗滌4次,每次10 min；包埋玻璃化法:將帶芽節(jié)段在含10.3％S、13.6％S、17.1％S的MS培養(yǎng)基內(nèi)各培養(yǎng)1 d,用褐藻酸鈉和氯化鈣包埋帶芽節(jié)段,包埋珠在室溫下用MS+

7、2 mol·L-1甘油+13.6％S裝載60 min,0℃下用PVS2脫水60min,更換新的PVS2,投入液氮,保存后在40℃水浴中快速化凍,用MS+40.8％S和MS+34.2％S的洗滌液各洗滌一次,每次停留10min。將三種方法洗滌后的帶芽節(jié)段接種于再生培養(yǎng)基中,于暗處培養(yǎng)一段時間后,轉入光下培養(yǎng),可再生植株。超低溫保存后成活率隨保存方法和基因型而異,分步冷凍法最高成活率為66％,玻璃化法最高成活率為79％,包埋玻璃化法最高成活率