全基因組范圍內(nèi)TCF7L2-TCF4結(jié)合位點(diǎn)確定及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-21的機(jī)制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是由神經(jīng)外胚層分化而來的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的腫瘤，是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤。中國顱內(nèi)腫瘤的平均年發(fā)病率為10/10萬，其中膠質(zhì)瘤占40％-67％。由于膠質(zhì)瘤呈浸潤性無限制增生，與正常腦組織無明顯界限，而且富于血管，手術(shù)很難完全切除。運(yùn)用現(xiàn)代顯微外科技術(shù)、放療、化療等綜合治療措施后，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后仍不理想。該情況在近30年的臨床實(shí)踐中未得到根本改善。因此膠質(zhì)瘤仍是神經(jīng)系統(tǒng)的難治性疾病，相關(guān)研究內(nèi)容是神經(jīng)系統(tǒng)的熱點(diǎn)課題。單純手術(shù)治療預(yù)后較差

2、，如今多采用手術(shù)治療輔助放療和化療的綜合治療的手段，但惡性膠質(zhì)瘤的總體治療效果仍不盡如人意，因此尋找有效地治療手段勢在必行。近年來，由于分子生物學(xué)取得的突破性進(jìn)展，目前許多研究表明，膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，這為開辟新的治療手段提供了新思路，因此采取針對腫瘤細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)通路上的特異分子的生物靶向藥物治療癌癥已經(jīng)成為新的發(fā)展趨勢。
　　Wnt/β-catenin信號途徑在胚胎發(fā)育過程以及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用.

3、由于其在人類不同腫瘤中的廣泛激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、遷移和分化，已被公認(rèn)為腫瘤發(fā)生過程中關(guān)鍵的信號通路之一。近年來大量文獻(xiàn)報(bào)道了Wnt通路在惡性膠質(zhì)瘤中異常激活，其重要作用因子beta-catenin的表達(dá)情況與病人的預(yù)后及生存質(zhì)量關(guān)系密切。Wnt通路是一條十分保守的信號傳導(dǎo)通路.從低等生物果蠅直至高等哺乳動物，其成員都具有高度的同源性.Wnt信號通路不僅在胚胎發(fā)育過程中具有重要作用而且在各種腫瘤中表現(xiàn)為異常激活狀態(tài)，也是現(xiàn)階段研究最深入

4、的分子通路，其在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮了巨大的影響著包括惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡等各種惡性表型在內(nèi)的生物學(xué)行為。
　　現(xiàn)已有大量研究證實(shí)，miRNA表達(dá)譜紊亂在癌癥發(fā)生過程中起著重要作用。在慢性淋巴細(xì)胞性白血病、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等等在內(nèi)的許多其他器官系統(tǒng)腫瘤中均存在miRNA表達(dá)譜的紊亂。特異性的miRNA表達(dá)紊亂可以被認(rèn)為是新的腫瘤分子標(biāo)簽。目前研究證實(shí)miRNA的主要致癌機(jī)制是與編碼基因的3’端結(jié)合，mRNA3

5、’UTR的5’端有長度為6～8個(gè)堿基被稱為miRNA結(jié)合種子序列?，F(xiàn)在認(rèn)為，miRNA調(diào)控基因表達(dá)的方式與miRNA和種子序列的互補(bǔ)程度有關(guān)。在哺乳動物、線蟲、果蠅中，大多數(shù)miRNA和種子序列不完全互補(bǔ)的方式結(jié)合發(fā)揮抑制mRNA翻譯成蛋白的作用。而在植物中，miRNA則是通過和種子序列完全互補(bǔ)進(jìn)而介導(dǎo)mRNA降解的方式來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。由于在哺乳動物細(xì)胞里，miRNA的不完全互補(bǔ)作用方式?jīng)Q定了一個(gè)miRNA可以有多個(gè)作用靶基因；相應(yīng)

6、地，某一個(gè)mRNA3’UTR種子序列也可以受眾多miRNA的調(diào)控作用。盡管目前miRNA在膠質(zhì)瘤中的研究仍處于起步階段，但已有大量文獻(xiàn)報(bào)道在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平異常的miRNA可能發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷與治療提供了新的方向。
　　本課題從基因網(wǎng)絡(luò)分析和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-21受β-catenin/TCF-4復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，為其直接靶點(diǎn)。本課題研究分以下三部分：
　　第一部分：T

7、CF4/TCF7L2通過與miRNAs啟動子區(qū)相結(jié)合而調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用TCF4ChIP-ChIP分析6，868個(gè)TCF4結(jié)合峰值從中找出TCF4結(jié)合區(qū)周圍的miRNAs。ChIP-PCR檢測在LS174T、MSF-7和U87三個(gè)不同細(xì)胞系中TCF4與miRNAs的啟動子區(qū)相結(jié)合。
　　第二部分：阿司匹林通過阻斷Wnt信號通路而改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性表型的研究。TOP-FOP實(shí)驗(yàn)檢測加入阿司匹林組后Wnt通路的活性，RT-PCR、We

8、steronBlot檢測Wnt信號通路下游靶點(diǎn)的變化。MTT實(shí)驗(yàn)檢測阿司匹林處理后細(xì)胞增殖的變化；FCM實(shí)驗(yàn)評價(jià)細(xì)胞周期的改變；AnnexinV實(shí)驗(yàn)檢測阿司匹林組與對照組細(xì)胞凋亡率的變化；transewell實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的改變。
　　第三部分：驗(yàn)證TCF4/TCF7L2對miR-21的直接調(diào)控作用。應(yīng)用各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)westernblot、pcr、免疫組化及熒光素酶等證明miR-21是Wnt/β-catenin信號通