MiR-21調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是人類最常見(jiàn)難治性顱內(nèi)惡性腫瘤，其中高度惡性的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤一年生存率僅為46％。近年發(fā)現(xiàn)了如EGFR基因過(guò)表達(dá)、PTEN基因表達(dá)缺失、p53基因突變等與該腫瘤發(fā)病相關(guān)的分子事件；從而認(rèn)識(shí)到膠質(zhì)瘤的發(fā)生是涉及細(xì)胞周期演進(jìn)調(diào)控失衡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成員異常表達(dá)、凋亡與死亡和細(xì)胞代謝紊亂等多種基因功能發(fā)生紊亂的病理過(guò)程。聯(lián)合基因治療是膠質(zhì)瘤基因治療的發(fā)展趨勢(shì)。因此，當(dāng)前關(guān)于如何實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)癌基因或者抑癌基因進(jìn)行調(diào)控成為腫瘤研究的核心問(wèn)題

2、。 MiRNA是一類平均長(zhǎng)度為22bp非編碼小RNA。MiRNA通過(guò)和靶基因3’非翻譯區(qū)種子序列完全和或不完全互補(bǔ)結(jié)合的形式來(lái)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的調(diào)控作用。每個(gè)miRNA具有數(shù)十種到甚至更多的蛋白表達(dá)調(diào)控靶點(diǎn)，而每一種蛋白表達(dá)有可能同時(shí)受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，目前人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的四百余種miRNA可以調(diào)控三分之一基因的表達(dá)水平。MiRNA因此被認(rèn)為對(duì)基因表達(dá)起著精細(xì)、廣泛的調(diào)節(jié)作用，也成為了腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。

3、 本課題重點(diǎn)研究了膠質(zhì)瘤中miRNA表達(dá)異常，應(yīng)用反義miRNA寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染技術(shù)干涉異常表達(dá)的miRNA對(duì)膠質(zhì)瘤惡性表型的影響以及和EGFR、PAKT-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系及其機(jī)制。 課題分四部分進(jìn)行： 方法： 第一部分使用晶芯()哺乳動(dòng)物miRNA微陣列芯片分析了5個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和1個(gè)星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系miRNA表達(dá)譜，篩選出一系列表達(dá)升高或者降低的miRNA，其中以miR-21在6個(gè)膠質(zhì)瘤

4、細(xì)胞系中表達(dá)升高最為均勻一致；并且我們使用Real-timePCR和原位雜交法對(duì)5個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系、1個(gè)正常細(xì)胞系、60例膠質(zhì)瘤標(biāo)本、10例髓母細(xì)胞瘤和6例正常腦組織miR-21表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證。并采取PCR方法對(duì)部分膠質(zhì)瘤標(biāo)本擴(kuò)增miR-21基因組DNA編碼區(qū)，直接測(cè)序，研究了膠質(zhì)瘤中基因組DNAmiRNA的擴(kuò)增和突變情況。 第二部分通過(guò)生物信息學(xué)手段，建立miRNA靶點(diǎn)選擇數(shù)學(xué)模型，結(jié)合現(xiàn)有miRNA靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-21在膠

5、質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中下游候選靶基因進(jìn)行篩選；克隆含有候選靶基因3’非翻譯區(qū)全部種子序列的熒光素酶報(bào)告載體，對(duì)miR-21候選靶基因進(jìn)行鑒定。 第三部分在體外應(yīng)用反義miRNA寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染技術(shù)以O(shè)ligofectamine介導(dǎo)AS-miR-21靶向miR-21轉(zhuǎn)染U251人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系后，應(yīng)用Real-timePCR和原位雜交法對(duì)miR-21表達(dá)敲低進(jìn)行檢測(cè)；并用免疫熒光和Westernblot技術(shù)檢測(cè)了miR-21敲低后，P1

6、3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成員、腫瘤惡性表型相關(guān)蛋白、以及我們實(shí)驗(yàn)室新近驗(yàn)證的腫瘤生長(zhǎng)抑制因子septin-7的表達(dá)變化；使用MTT、AnnexinV法、流式細(xì)胞術(shù)及Matrigel2D、3D生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)等方法分析了轉(zhuǎn)染前后U251細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布和侵襲能力的變化。 第四部分中則通過(guò)建立裸鼠膠質(zhì)瘤皮下動(dòng)物模型，瘤內(nèi)注射Oligofectamine和AS-miR-21混合物，動(dòng)態(tài)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，檢測(cè)反義miRNA寡聚核苷酸

7、轉(zhuǎn)染技術(shù)敲低U251裸鼠膠質(zhì)瘤miR-21表達(dá)后，P13K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成員等蛋白表達(dá)水平的變化，并且使用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)果： MiRNA表達(dá)譜結(jié)果顯示：在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，miR-21等8種miRNA-致表達(dá)上調(diào)超過(guò)正常腦組織的2倍；一致表達(dá)下調(diào)的miRNA包括miR-127等18種miRNA一致表達(dá)下調(diào)為正常腦組織的50％以下；Real-timePCR證實(shí)，miR-21在

8、膠質(zhì)瘤中高表達(dá)：另外，原位雜交顯示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-21高表達(dá)，在60例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中miR-21表達(dá)水平和病理分級(jí)正相關(guān)，在髓母細(xì)胞瘤和正常腦組織中miR-21表達(dá)缺失。通過(guò)數(shù)學(xué)模型推測(cè)PTEN和Septin-7是miR-21潛在作用靶點(diǎn)：PTEN基因mRNA得分為93.837，自由度為-7，預(yù)測(cè)種子序列起始于3’UTR第23個(gè)堿基；Septin-7基因mRNA得分為94.0019，自由度為-8，預(yù)測(cè)種子序列起始于3’UTR第51

9、5個(gè)堿基。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示共轉(zhuǎn)染PTEN、Septin-73’UTR的熒光素酶報(bào)告載體和AS-miR-21組的熒光值顯著高于單轉(zhuǎn)染報(bào)告載體組。Real-timePCR和原位雜交結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染AS-miR-21后可以顯著抑制miR-21表達(dá)水平。MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染AS-miR-21后細(xì)胞增殖率與轉(zhuǎn)染無(wú)義ODN和對(duì)照組相比明顯受抑(P=0.000)，通過(guò)免疫熒光和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EGFR、P13K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要

10、成員表達(dá)水平和Bcl-2等腫瘤惡性生物學(xué)表型相關(guān)蛋白均明顯降低，Septin-7、TMP-1等腫瘤生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)升高。應(yīng)用AnnexinV檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染AS-miR-21組細(xì)胞凋亡率明顯升高，進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，S期細(xì)胞比例降低。成功建立U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞系裸鼠皮下腫瘤后，每3天測(cè)量一次腫瘤體積，并在腫瘤局部多點(diǎn)注射AS-miR-21和Oligofectamine混合物，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照

11、組、無(wú)義對(duì)照組相比，AS-miR-21治療組腫瘤生長(zhǎng)緩慢，腫瘤體積差別在觀察末期(24天)最顯著。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)腫瘤標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，miR-21表達(dá)水平被敲低后，EGFR、PAKT-P13K等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要成員(AKT-2、PAKT等)表達(dá)水平、腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67、腫瘤凋亡抑制相關(guān)蛋白Bcl-2、細(xì)胞周期正向演進(jìn)相關(guān)蛋白CyelinD、侵襲相關(guān)蛋白MMP-9、均明顯降低，Septin-7、TIMP-1等腫瘤生長(zhǎng)抑制因子表達(dá)升

12、高。應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)原位細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)AS-miR-21治療組凋亡細(xì)胞核比例明顯增加。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.膠質(zhì)瘤中存在一系列miRNA表達(dá)異常，miR-21過(guò)表達(dá)可以被認(rèn)為是人腦膠質(zhì)瘤新的分子標(biāo)簽。 2.PTEN、Septin-7基因mRNA的3’UTR是miR-21直接作用靶點(diǎn)。 3.Oligofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染AS-miR-21可有效敲低miR-21在U251人膠質(zhì)母細(xì)胞

13、瘤細(xì)胞系的表達(dá)，同時(shí)抑制EGFR、P13K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，上調(diào)Septin-7表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞的增殖和侵襲能力，出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 4.裸鼠皮下膠質(zhì)瘤模型應(yīng)用Oligofectamine介導(dǎo)的AS-miR-21治療，同樣可有效敲低miR-21的表達(dá)，抑制EGFR、PAKT-P13K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，上調(diào)Septin-7表達(dá)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與體外試驗(yàn)結(jié)果一致。 5.