從全基因組水平研究PML-RARα融合蛋白的轉錄調控機制.pdf

1、基因轉錄調控是生命科學研究的核心,其無論對于了解正常的生理發(fā)育還是異常的疾病發(fā)生過程都有著非同尋常意義.而染色質免疫沉淀與高通量基因芯片相結合的ChiP-on-chip(chromatin immunoprecipitationon chip)技術則使得人們能夠從全基因組水平研究轉錄因子的結合位點,從而為全面、系統(tǒng)性地研究基因的轉錄調控網絡提供了一種強有力的手段.在與疾病發(fā)生相關的模型中,急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelo

2、cytic leukemia,APL)中PML-RARα融合蛋白(異常轉錄因子)堪稱是最佳的模型.該融合蛋白能夠與體內正常的轉錄因子維甲酸受體(RARα)發(fā)生競爭、并與其在DNA上的結合序列一維甲酸反應元件(RAR response elemem,RARE)進行結合、產生顯性抑制(dominantnegative)的效果,從而對一系列與造血細胞分化相關的RARa所調節(jié)的靶基因產生表達抑制效果,使得細胞停滯在早幼粒細胞階段、形成白血病.而

3、全反式維甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)則在相當程度上可以逆轉PMI-RARα的顯性抑制效果、能夠重新激活與造血細胞分化相關的維甲酸受體所調節(jié)的靶基因.盡管在過去的近二十年中,PML-RARa的研究取得了一系列重要的進展,但人們對于PML-RARα所直接涉及的轉錄調控網絡了解甚少,尤其在PML-RARα所調控的靶基因方面更是缺少系統(tǒng)、全面性的研究,缺乏PMI-RARa與下游功能性及轉錄調控網絡的有機聯系.

4、 因此,本課題以體外轉染PML-RARα的細胞U937-PR9為模型,建立了ChIP以及ChiP-on-chip等技術平臺并結合相應的轉錄組數據,從全基因組的水平系統(tǒng)性地研究了PMI,-RARQ異常轉錄因子所潛在調節(jié)的靶基因、并就相關的下游功能性通路進行了較為全面的討論. ChiP-on-chip技術的成功與否在很大程度上取決于前期ChIP過程的成功與否.因此,本課題首先就該過程中的各主要環(huán)節(jié)進行了嚴格的質控,并通過分析

5、、驗證,建立了統(tǒng)一的標準,從而使得ChIP技術在本實驗室成為繼基因芯片技術、相關生物信息技術之后的又一穩(wěn)定的技術平臺.高質量的ChIP平臺為高質量的ChiP-on-chip提供了保證.通過對全基因組轉錄調控區(qū)域的掃描,本課題共識別了2365個PMI-RARa的蛋白結合位點,代表了1501個潛在的靶基因.同時,這些結合位點在基因組內的分布也呈現出一定的規(guī)律性:如約60﹪以上結合位點都分布在轉錄起始點(transcriptional sta

6、rt sites,TSS)周圍(上游-2000bp-+2000bp).而這種分布與為數不多、已報道的轉錄因子的結合位點分布情況十分吻合.這從另一方面也反映了本研究的可靠性.由于ChIP-on-chip技術本身存在著假陽性率高、以及部分結合位點的生物學基礎不明朗的原因,本課題將"靜態(tài)"的ChlP-on-chip數據與"動態(tài)"的轉錄組數據(如APL臨床樣本、APL臨床樣本體外ATRA用藥、NB4細胞ATRA用藥、APL轉基因小鼠ATRA用藥

7、等表達譜芯片數據)進行有機的整合,并進行相應的統(tǒng)計學處理.只有那些即出現在ChIP-on-chip數據中又出現在各種APL相關的表達譜數據中、同時在統(tǒng)計學多重假設檢驗中具有顯著性差異的基因才被認為是PML-RARα所調節(jié)的靶基因,其中包括:與細胞增殖分化相關的BAG-1、BCL2A1、CFLAR、CLCF1和MCL1等基因;與染色質結構重塑相關的CHD1、CHD3、CHD4和HMGB2等基因;與轉錄調控相關的BHLHB2、IRF1、IR

8、F2、ID2、CEBPE和LMO2等基因;以及和泛素蛋白酶體系統(tǒng)相關的UBC、UBR2、PSMB8和PSMB10等基因.上述基因所涉及的功能性網絡大多數在PML-RARα存在的情況下受到抑制,從而導致正常的血細胞分化受阻、增殖失控.而ATRA用藥則在相當程度上解除了這種抑制、恢復了細胞分化的潛能. 本研究的相關發(fā)現不僅有助于深入了解 APL發(fā)生、及ATRA用藥恢復過程中分子網絡的變化,更重要的是為研究其它惡性腫瘤相關的轉錄調控網