維胃方對(duì)大鼠胃潰瘍的療效及血清白介素2影響的研究.pdf

1、課題背景:
　　 消化性潰瘍(peptic ulcer,PU)泛指胃腸道黏膜被胃液所消化而形成深達(dá)黏膜下層的黏膜破損,可發(fā)生于食管、胃、十二指腸,以及胃空腸吻合口、含胃粘膜的Meckel憩室內(nèi)。臨床以胃潰瘍(gastric ulcer,GU)和十二指腸潰瘍(duodenalulcer,DU)常見。PU是臨床常見病、多發(fā)病,呈世界性分布。流行病學(xué)調(diào)查表明,約有10％的人口在其一生中患過本病。隨著H2受體阻滯劑及質(zhì)子泵抑制劑的相繼問

2、世,使?jié)兊闹斡蚀鬄樘岣?但潰瘍的復(fù)發(fā)問題仍未得到根本解決。尋求有效的藥物治療以提高潰瘍愈合質(zhì)量,成為當(dāng)今醫(yī)藥界研究的熱點(diǎn)之一。中醫(yī)藥在胃潰瘍治療上歷史悠久、具有獨(dú)特優(yōu)勢,因此受到廣泛關(guān)注。
　　 消化性潰瘍的發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜,迄今尚未完全闡明。概括起來,本病是胃、十二指腸局部粘膜損害因素和粘膜保護(hù)因素之間失去平衡所致。目前認(rèn)為消化性潰瘍是一種多病因疾病,各種與發(fā)病有關(guān)的因素如胃酸、胃蛋白酶、感染、遺傳、體質(zhì)、環(huán)境、飲食、生活

3、習(xí)慣、神經(jīng)精神因素等,通過不同途徑或機(jī)制,導(dǎo)致上述侵襲因素增強(qiáng)和(或)防護(hù)因素減弱,使?jié)儼l(fā)生。
　　 近期研究發(fā)現(xiàn),許多細(xì)胞因子與胃潰瘍的發(fā)生、發(fā)展及愈合過程密切相關(guān)。IL-2是主要由T淋巴細(xì)胞分泌的一種淋巴因子,它可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖和分化,促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體,還能促進(jìn)多種淋巴因子的合成與釋放及抗體生成,共同發(fā)揮免疫功能,在機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)、抗損傷和抗腫瘤免疫等方面具有重要的作用[1]。其產(chǎn)生和表達(dá)異常,可對(duì)機(jī)體的

4、免疫調(diào)節(jié)機(jī)能、疾病、損傷等具有提示作用[2],IL-2 水平高低可作為機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。
　　 維胃方是導(dǎo)師臨床上治療胃潰瘍的經(jīng)驗(yàn)方,前期已從一氧化氮、胃泌素、表皮生長因子、神經(jīng)降壓素、氨基己糖、前列腺素等指標(biāo)進(jìn)行了研究。本課題是在觀察維胃方對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍的治療作用的基礎(chǔ)上,應(yīng)用放射免疫法測定血清IL-2的含量,比較不同劑量維胃方及雷尼替丁對(duì)胃潰瘍大鼠的免疫學(xué)指標(biāo)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并從免疫學(xué)角度分析潰瘍形成因?yàn)?探討

5、維胃方在潰瘍愈合過程中可能的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥的臨床運(yùn)用和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)分組及給藥:
　　 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠56只,體重220-260g,室溫22-26℃安靜環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物嚴(yán)格按完全隨機(jī)分配原則分為7組,每組8只。正常組:正常飼養(yǎng)；模型組:冰醋酸致大鼠胃潰瘍?cè)炷Ｐg(shù)后第4天,處死取材；自愈組:造模后自由飲水、進(jìn)食,不施加藥物干預(yù)；維胃方高、中、低劑量組、雷尼替

6、丁組:造模術(shù)后第4天開始分別灌服高、中、低劑量維胃方、雷尼替丁混懸液,每日1次,共7天,并正常飲食。除模型組外,其余各組大鼠在造模后第11天處死取材。
　　 2、冰醋酸致大鼠胃潰瘍模型制備:
　　 參照Takagi等[3]的經(jīng)典造模方法,并加以改進(jìn)。大鼠造模前24h禁食不禁水,腹腔注射10％水合氯醛麻醉。固定四肢、腹部剃毛、消毒、鋪手術(shù)洞巾,于劍突下腹中線稍左縱向打開腹腔,手術(shù)切口長約1-2cm,將胃輕輕移出腹腔,在胃前

7、壁漿膜面靠胃竇側(cè)用100％冰醋酸浸泡過的直徑為5mm的圓形濾紙壓貼30秒×2次,用生理鹽水棉簽輕輕抹洗2次,然后將胃還納腹腔,分層縫合腹壁肌肉和皮膚,75％酒精棉球再次消毒切口及周圍。
　　 3、標(biāo)本采集及主要實(shí)驗(yàn)方法:
　　 3.1血清IL-2含量:腹主動(dòng)脈采血約3ml于普通負(fù)壓采血管中,4℃冰箱中靜置待自然凝固后,以2000r/min離心10min,分離血清并保存于-20℃冰箱中。采用放射免疫法測定血清IL-2含量,

8、操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
　　 3.2胃液PH值:在劍突下偏左剪開腹部,暴露胃部。結(jié)扎賁門,分別于十二指腸和食管處剪斷并取出鼠胃,由幽門擠出少量胃液于PH試紙上,讀取并記錄PH值。
　　 3.3潰瘍面積:由幽門處向胃內(nèi)注入10％中性福爾馬林溶液10ml,固定10 min后沿胃大彎剪開,展平,用游標(biāo)卡尺測量潰瘍面的最大橫徑及最大縱徑,分別記為d1、d2。潰瘍面積(S)按公式S=π×d1×d2×1/4計(jì)算(π取3.14)。<

9、br>　　 3.4胃黏膜病理組織切片制備:以潰瘍瘢痕平行于胃長軸方向的最長徑為中心取材,放入10％中性福爾馬林溶液中固定,常規(guī)脫水、包蠟、切片、HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。
　　 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)比較。大鼠潰瘍面積、胃液pH值及血清IL-2的比較結(jié)果均顯示方差齊性,各

10、組間存在差異,采用LSD法檢驗(yàn)。顯著性水平為P＜0.05。
　　 主要結(jié)果:
　　 1、肉眼觀察標(biāo)本:正常組大鼠胃黏膜光整完好。模型組:胃竇處見火山口樣潰瘍,底部覆蓋有黃白苔。自愈組:漿膜面充血,與周圍組織粘連,胃竇區(qū)黏膜潰瘍愈合不全。雷尼替丁組:漿膜面少有粘連,胃竇區(qū)黏膜潰瘍多數(shù)基本愈合,表面粗糙色白。維胃方低、高劑量組:部分可見漿膜面粘連,胃竇黏膜可見少數(shù)潰瘍點(diǎn)或瘢痕組織增生；中劑量組:漿膜面少粘連,胃黏膜表面多數(shù)已

11、愈合,僅見極少潰瘍點(diǎn)或小范圍瘢痕增生。
　　 2、鏡下觀察病理切片:正常組黏膜層完整,腺細(xì)胞排列均勻。模型組潰瘍處粘膜缺損大,腺體完全被破壞；黏膜下層毛細(xì)血管內(nèi)見血流淤滯,部分毛細(xì)血管破裂、出血,粘膜下層、漿膜層見大量炎性細(xì)胞浸潤。自愈組:部分黏膜缺損達(dá)黏膜肌層,再生腺細(xì)胞排列紊亂；黏膜下層有炎細(xì)胞浸潤,見明顯血栓。雷尼替丁組:缺損較小,表面見新生上皮細(xì)胞及腺細(xì)胞,排列致密不整齊；黏膜下層有炎細(xì)胞浸潤,肌層見瘢痕纖維形成。維胃方

12、各劑量組:維胃方組低、高劑量組可見缺損達(dá)腺細(xì)胞層,再生腺細(xì)胞密度不勻,黏膜下層炎細(xì)胞浸潤,其中高劑量組腺體細(xì)胞增生數(shù)量較多,黏膜下血管未見明顯病理改變,但仍有炎性細(xì)胞浸潤；中劑量組黏膜基本完整,腺體細(xì)胞增生數(shù)量較多；黏膜下層僅見少量炎性細(xì)胞浸潤。
　　 3、胃液PH值:模型組PH值明顯高,與正常組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),各用藥組與模型組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。維胃方中、低劑量組、雷尼替丁組與正常組比

13、較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其中維胃方中、低劑量組更接近正常組。
　　 4、潰瘍面積:用藥組與自愈組潰瘍面積的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；維胃方中劑量組與雷尼替丁組存在顯著性差異(P＜0.01),表明維胃方中劑量治療效果優(yōu)于雷尼替丁。
　　 5、血清IL-2含量的比較:各用藥組與自愈組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01):維胃方中、高劑量組的IL-2水平較高與正常組無顯著性差異(P＞0.05)；維胃方中劑量與雷尼替丁組的差

14、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、動(dòng)物模型:采用冰醋酸燒灼胃漿膜面形成潰瘍的方法,通過肉眼及鏡下觀察,其表現(xiàn)與人類潰瘍極為相似,且造模成功率高,方法簡單,可操作性強(qiáng),是目前普遍認(rèn)可用于觀察藥物療效的模型。
　　 2、肉眼觀察胃黏膜標(biāo)本發(fā)現(xiàn),各用藥組大鼠潰瘍較之模型組及自愈組愈合更好,維胃方各組的潰瘍面積均小于自愈組,其中以維胃方中劑量組效果最好。
　　 3、光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜病

15、理組織切片,模型組大鼠黏膜各層破壞較嚴(yán)重,黏膜下循環(huán)病理改變明顯,多數(shù)用藥組大鼠黏膜愈合較好,其中鏡下觀察以維胃方中劑量組最佳。
　　 4、胃液PH值:模型組pH值明顯高于正常組,因?yàn)榭赡転樵炷：蟠笫笪葛つな軗p傷,腺體被破壞,泌酸功能隨之降低:藥物可以使受損胃黏膜修復(fù),促進(jìn)腺體增生,逐漸恢復(fù)泌酸功能。
　　 5、血清IL-2:維胃方各組大鼠血清IL-2 與自愈組有顯著性差異,提示維胃方能通過升高IL-2水平,促進(jìn)T淋巴細(xì)