雞源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白（MOMP）基因重組腺病毒活載體疫苗研究.pdf

1、本研究分離了雞源鸚鵡熱衣原體，建立了雞衣原體病PCR診斷方法。利用E1和E3缺失的人腺病毒5型載體，首次在國內(nèi)外成功構(gòu)建了含有雞源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白(MOMP)基因的重組腺病毒。并用重組腺病毒對(duì)本動(dòng)物雞進(jìn)行了免疫試驗(yàn)和安全試驗(yàn)。 (1)從疑似患鸚鵡熱衣原體病雞分離到衣原體，經(jīng)涂片觀察、接種雞胚，碘染色試驗(yàn)、磺胺嘧啶鈉試驗(yàn)、電子顯微鏡觀察，確定為鸚鵡熱衣原體，命名為hnq株，用雞胚法測(cè)定其毒力為1.8×10-7/0.2ELD

2、50，CpL株的毒力為5.6×10-10/0.2ELD50。選擇CpL株為研究對(duì)象。建立了雞源鸚鵡熱衣原體PCR診斷方法，并對(duì)其特異性、敏感性和靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證。 (2)對(duì)雞源鸚鵡熱衣原體CpL株MOMP基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序，并與禽源鸚鵡熱衣原體其他菌株的MOMP基因進(jìn)行了序列比較。結(jié)果表明，與禽源衣原體鴨(GD)株的MOMP氨基酸序列同源性為89.7％；與火雞(CT1)株MOMP氨基酸序列同源性為88.7％；與鴿子(CP3)株

3、MOMP氨基酸序列同源性為82.3％；與長(zhǎng)尾小鸚鵡(VS225)株的MOMP氨基酸序列同源性為94.4％。 (3)通過基因操作的方法，將雞源鸚鵡熱衣原體CpL株MOMP基因置于腺病毒穿梭載體的巨細(xì)胞瘤(CMV)啟動(dòng)子和SV40Poly(A)尾巴之間，構(gòu)建成目的基因的表達(dá)盒。構(gòu)建的穿梭載體與腺病毒骨架載體在BJ5183工程菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，篩選陽性重組腺病毒質(zhì)粒，命名為Ad-MOMP。序列測(cè)定表明，Ad-MOMP重組腺病毒所帶的雞

4、源鸚鵡熱衣原體MOMP基因的氨基酸序列完全正確。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用間接免疫熒光對(duì)表達(dá)產(chǎn)物檢測(cè)，證明所構(gòu)建的重組腺病毒能正確表達(dá)目的基因。減蛋綜合征(EDS76)陽性血清中和試驗(yàn)表明，不能中和重組腺病毒。重組腺病毒穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該重組病毒能穩(wěn)定攜帶外源基因進(jìn)行傳代(23代)。 (4)禽源鸚鵡熱衣原體MOMP基因重組腺病毒免疫SPF小雞，第21天測(cè)定抗MOMP抗體，達(dá)到1：32，用6.8×109TCID50免疫SPF小雞，能

5、夠抵抗5.6×1010ELD50同源強(qiáng)毒CpL株的攻擊獲得保護(hù)，保護(hù)率達(dá)9/10；用減蛋綜合征病毒(EDS76V)檢測(cè)重組腺病毒抗體，表明二者無抗原一抗體交叉反應(yīng)。用野生型腺病毒和HEK293細(xì)胞免疫的對(duì)照組均未產(chǎn)生任何的免疫保護(hù)效果。肌肉與皮下兩種免疫途徑試驗(yàn)結(jié)果表明，二者基本無差別，考慮到田間免疫的實(shí)用性，選擇肌肉免疫。 (5)根據(jù)SPF小雞免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果，用6.8×109TCID50重組腺病毒一次肌肉免疫7日齡小雞，21

6、天后用同源強(qiáng)毒CpL株進(jìn)行攻擊，觀察結(jié)果6個(gè)月，表明免疫小雞能夠抵抗1.1×1010ELD50鸚鵡熱衣原體強(qiáng)毒的攻擊，保護(hù)率達(dá)8/10。對(duì)照組10只雞剖檢后全部表現(xiàn)出鸚鵡熱衣原體癥狀?？贵w持續(xù)期試驗(yàn)表明，免疫后21天抗體水平達(dá)到最高(1∶64)，隨后開始逐漸下降，至180天時(shí)，抗體水平仍然維持在保護(hù)水平。應(yīng)用衣原體IHA和四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)了小雞的體液免疫和細(xì)胞免疫，表明二者都有應(yīng)答。重組腺病毒安全性試驗(yàn)表明，小雞生長(zhǎng)正常，