禽鸚鵡熱嗜性衣原體DNA疫苗的構(gòu)建和免疫應(yīng)答評價.pdf

1、禽鸚鵡熱嗜性衣原體是一種重要的人畜共患病，隨著我國集約化養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，禽鸚鵡熱嗜性衣原體的感染呈現(xiàn)上升的趨勢，本病的流行已嚴重阻礙養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和威脅人類健康。目前尚未有商品化的禽鸚鵡熱嗜性衣原體疫苗上市，因此，開發(fā)高效、價廉的新型疫苗勢在必行。已有研究證明衣原體Omp-1基因編碼的主要外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein，MOMP)是其主要保護性抗原成分且具有種屬特異性，本實驗克隆Omp-1基因并構(gòu)建了

2、pcDNA3-1-Omp-1DNA疫苗，同時配合重組主要外膜蛋白和佐劑CpG免疫SPF雞旨在探討增強鸚鵡熱嗜性衣原體DNA疫苗的途徑。 方法： ①根據(jù)禽鸚鵡熱嗜性衣原體Omp-1基因序列，設(shè)計了一對含有EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ酶切位點的引物。利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增禽鸚鵡熱嗜性衣原體Omp-1基因，用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切該片段，回收得到含有以上兩個酶切位點粘端的Omp-1基因，將此基因克隆至相同酶切回收后

3、的pcDNA3.1(+)真核表達載體中。 ②純化重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-Omp-1，脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞BHK<,21>，RT-PCR和Western-blot方法鑒定目的基因在BHK<,21>細胞中的瞬時表達。 ③根據(jù)文獻報道合成了一條禽用硫代磷酸化修飾的CpG序列5’TCGTCGTTTTGTCGTITTGTCGTT3’(命名為CpG2006)。36只SPFg鳥隨機分成6組后，將pcDNA3.1-O

4、mp-1與r-MOMP、CpG以不同組合進行兩次免疫，以空質(zhì)粒、免疫佐劑組做對照。二免后14天采血，以間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)和MTT法T淋巴細胞增殖(LTT)試驗分別檢測特異性抗體和淋巴細胞增值水平。二免14天后進行攻毒，攻毒后第7天采集泄殖腔棉拭子，免疫熒光抗體檢測SPF雞排除衣原體的狀況；攻毒18天后，宰殺所有的SPF雞，采集脾臟、肺臟，免疫組化染色觀察清除禽鸚鵡熱嗜性衣原體的狀況。 結(jié)果： ①獲得重組

5、質(zhì)粒pcDNA3.1- Omp-1。經(jīng)PCR鑒定、限制性內(nèi)切酶分析和克隆片段序列測定、比較，證實了重組質(zhì)粒的正確性。 ②RT-PCR和Western-blot證實構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1- Omp-1能夠在哺乳動物細胞中表達：MOMP蛋白。 ③單獨免疫r-MOMP能夠誘發(fā)高水平的抗體，單獨免疫pcDNA3.1- Omp-1能誘導(dǎo)中等水平的淋巴細胞增值。免疫DNA疫苗的雞具有較好的衣原體清除效果，配合CpG200