海兔素在肝微粒體中酶動力學(xué)及對酒精損傷大鼠Fas-FasL、TNF-α表達(dá)影響研究.pdf

1、目的：研究海兔素(Aplysin)在大鼠肝微粒體體外代謝中的酶動力學(xué)以及CYP3A的特異性抑制劑酮康唑?qū)Ｍ盟伢w外代謝的影響;觀察海兔素對酒精性肝損傷大鼠肝組織Fas、FasL表達(dá)及血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響。
　　方法：1、15只雄性Wistar大鼠，頸椎脫臼處死，采用鈣沉淀法制備大鼠肝微粒體，并通過BCA法測定大鼠肝微粒體的蛋白濃度。建立測定大鼠肝微粒體孵育液中海兔素含量的高效液相色譜法(HPLC)，考察不同

2、孵育時間(10、20、30、45、60、90 min)、肝微粒體蛋白濃度（0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL）、海兔素濃度(1，2，5，10，20，40，80 mg/L)對代謝反應(yīng)的影響，并采用雙倒數(shù)作圖法計算海兔素的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)(Km、Vmax、CLint);觀察不同濃度酮康唑(0.5，2，5，10，20，40 mg/L)對海兔素體外代謝的影響。2、50只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組。正常對照組，每日

3、灌胃生理鹽水1次;酒精模型組，每日給予50％乙醇8 mL/（kg·bw·d）灌胃，2周后把50％乙醇劑量遞增為12 mL/(kg·bw·d)，繼續(xù)灌胃4周;海兔素低、中、高劑量組，每日分別給予Aplysin50、100、150 mg/(kg·bw·d)灌胃，酒精劑量同模型組。實驗進(jìn)行了6周。末次灌胃12h后，大鼠稱重后給予7％水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，留取肝組織，計算肝指數(shù);HE染色觀察肝臟組織的病理學(xué)改變;免疫組化法檢測肝組織中Fa

4、s、FasL表達(dá)情況，計算其陽性表達(dá)率;并采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中TNF-α的濃度。
　　結(jié)果：1、海兔素在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度在92.42％～100.58％，日內(nèi)、日間精密度均小于3.18％，提取回收率在96.19％～97.83％，室溫24 h和-20℃冷凍一周穩(wěn)定性良好，RSD均小于1.941％;海兔素在大鼠肝微粒體中代謝的最佳溫孵時間為30 min、最佳肝微粒體蛋白濃

5、度為1 mg/mL，并確定了酶動力學(xué)參數(shù)，米氏常數(shù)Km為19.72 mg/L、最大反應(yīng)速率Vmax為0.35 mg/min/gProtein、固有清除率CLint為17.75 mL/min/g Protein; CYP3A的特異性抑制劑酮康唑能夠明顯抑制海兔素的體外代謝，最大抑制率為68％。2、與正常對照組相比，酒精模型組大鼠肝指數(shù)明顯增加(P＜0.05);與酒精模型組相比，海兔素中、高劑量組大鼠肝指數(shù)均顯著降低(P＜0.05)。HE染

6、色病理觀察結(jié)果顯示，酒精模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)中可見大小不等、數(shù)量不一的圓形脂肪空泡，可見炎性細(xì)胞浸潤;海兔素各劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，與酒精模型組相比較，肝細(xì)胞壞死程度明顯減輕。酒精模型組與正常對照組相比Fas/FasL表達(dá)明顯增多，且血清TNF-α含量明顯升高(P＜0.05);海兔素各劑量組Fas/FasL表達(dá)以及血清中TNF-α含量均低于酒精模型組，差異有顯著性(P＜0.05);隨著海兔素攝入劑量的增加Fas表達(dá)相