假型病毒載體介導(dǎo)tPA基因轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細胞的實驗研究.pdf

1、目的:通過新構(gòu)建的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(VSV-G/MuLV),介導(dǎo)組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plaminogen activator,tPA)基因,轉(zhuǎn)導(dǎo)乳鼠心肌成纖維細胞,探索心肌成纖維細胞成為tPA基因治療靶細胞的可能性.方法:1、疹型口炎病毒殼G糖蛋白(VSV-G)替代MuLV的env蛋白,從而產(chǎn)生一種有轉(zhuǎn)染能力的以MuLV為基礎(chǔ)的病毒載體,稱為VSV-G假型MuLV載體(VSV-G/MuLV),通過293T/1

2、7細胞共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCnBgSN、pHIT60(for gal-pol)和pCVG(for VSV-G),采用磷酸鈣共沉淀法產(chǎn)生;VSV-G/MuLV病毒生產(chǎn)細胞293/GPG的產(chǎn)生;VSV-G/MuLV病毒上清的收集及滴度測定.2、采用兩次差速貼壁法(每次持續(xù)60分鐘)分離、培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維纖胞;通過倒置顯微鏡觀察心肌成纖維細胞的形態(tài)學(xué)特征;用免疫細胞化學(xué)染色法(SP法)鑒定心肌成纖維細胞.3、制備含tPA基因假型病毒載體VSV-G/

3、tPA,通過質(zhì)粒pHIT60(for gal-pol)、pCVG(for VSV-G)和pLtSN(for tPA),同時瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生;含tPA基因的VSV-G/tPA病毒轉(zhuǎn)染293/GPG細胞,收集病毒上清并測滴度;含tPA基因的VSV-G/tPA病毒上清液轉(zhuǎn)染乳鼠心肌成纖維細胞,用G418藥物篩選,觀察轉(zhuǎn)染后心肌成纖維細胞克隆形成情況;發(fā)色底物法測定轉(zhuǎn)基因心肌成纖維細胞培養(yǎng)上清液中tPA蛋白活性在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后的動態(tài)變化;免