非病毒多基因納米傳遞與成纖維細胞的神經分化研究.pdf

1、直接重編程是指將一種終末分化的細胞直接轉變成另一種終末分化的細胞，這一技術的產生為細胞移植在臨床中的應用提供了新的細胞來源。在成神經細胞分化的研究中主要依靠病毒載體，而病毒載體本身具有潛在的安全隱患，使該技術的應用受到限制,納米粒具有安全、高效等優(yōu)點，已經受到越來越多的關注。本文重點圍繞神經細胞的直接重編程展開研究，通過制備乙二胺修飾的陽離子化紫菜多糖，并將其作為基因載體攜神經相關轉錄因子，將小鼠成纖維細胞直接重編程為神經細胞，主要分為

2、四個部分：
　　第一章綜述
　　本章對基因治療中載體的發(fā)展進行了簡要綜述，比較了不同載體的優(yōu)缺點，對各載體的應用作了簡單介紹；并對可用于治療神經系統(tǒng)疾病的細胞來源，不同來源細胞的優(yōu)缺點以及細胞來源途徑的發(fā)展趨勢及面臨的問題進行了簡要敘述，為本學位論文設計思想的提出及后續(xù)實驗工作的開展奠定基礎。
　　第二章陽離子化紫菜多糖的制備及表征
　　本項目研究以紫菜多糖為對象，采用高碘酸鉀氧化法對紫菜多糖進行氧化，再利用乙二

3、胺及精胺兩種陽離子化試劑分別對氧化后的紫菜多糖進行陽離子化，得到乙二胺陽離子化紫菜多糖（Ed-PYP）和精胺陽離子化紫菜多糖（Sm-PYP），采用傅里葉變換紅外光譜分析儀對兩種陽離子化的多糖進行結構檢測，采用Zeta電位粒徑儀對其進行表征，為進一步研究陽離子化紫菜多糖在基因載體中的應用打下基礎。
　　第三章乙二胺陽離子化的紫菜多糖作為基因載體的初步探究
　　以陽離子化多糖為載體，成纖維細胞為種子細胞，通過瓊脂糖凝膠電泳對Ed

4、-PYP/pDNA復合物表征，采用MTT實驗對其進行毒性檢測，實驗結果初步表明其具有載基因能力。通過綠色熒光蛋白（EGFP）及ELISA分別從可視化角度及蛋白水平來評價 Ed-PYP/pDNA復合物的體外轉染效率，結果表明在Ed-PYP/pDNA質量比為40:1，其體外轉染效率為最佳且優(yōu)于PEI及Lip2000。通過質粒 DNA的熒光標記物 YOYO-1以及多種特異性抑制劑考察Ed-PYP/pDNA納米粒（40:1）的穿膜機制及胞內轉運

5、機理。結果表明， Ed-PYP/pDNA復合物是通過網格蛋白以及小窩蛋白介導的內吞途徑進入胞內，而其在胞內的轉運過程是由內涵體-溶酶體系統(tǒng)、細胞骨架結構、中間纖維結構以及動力蛋白多系統(tǒng)參與的。
　　第四章成纖維誘導分化為神經的研究
　　根據(jù)前文研究結果，將Ed-PYP與神經相關轉錄因子的復合物按最佳比例（40:1）混合制成納米粒（Ed-PYP/pABF、Ed-PYP/pABT）用于轉染成纖維細胞，擬對其進行成神經誘導分化，經