目的基因過表達慢病毒顆粒感染人心肌成纖維細胞的實驗研究.pdf

1、目的：將KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因載入慢病毒顆粒，探討目的基因過表達慢病毒顆粒感染人心肌成纖維細胞使之重編程為誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)的關(guān)鍵技術(shù)。
　　 方法：采用直接貼壁法分離培養(yǎng)出人心肌成纖維細胞(Human cardiacfibroblasts，HCFs)，取孕13.5～14.5d昆明胎鼠，采用胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)出小鼠胚胎成纖維細胞(Mo

2、use embryonic fibroblasts，MEFs)：分別在倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，以臺盼藍染色、免疫細胞化學染色檢測細胞活力及鑒定。采用絲裂霉素-C(Mitomycin C，MMC)處理胚胎成纖維細胞制備飼養(yǎng)層細胞。分別構(gòu)建和包裝含KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因過表達的慢病毒顆粒、含綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的慢病毒顆粒。將表達綠色熒光蛋白的慢病毒顆粒感染人心

3、肌成纖維細胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察感染效率及熒光表達情況，篩選最佳感染條件及感染復數(shù)(Multiplicity ofinfection，MOI值)；將含KLF4、OCT4、SOX2、C-MYC基因過表達的慢病毒顆粒感染人心肌成纖維細胞，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)變化，篩選最佳實驗室條件。
　　 結(jié)果：采用組織塊直接貼壁法多次、同時貼壁多個組織塊可獲得足量的HCFs，其雜細胞少，活力佳，細胞呈長梭形，無自發(fā)性搏動。選取孕13.5～1