四種病毒載體對人成纖維細胞轉染效率的研究.pdf

1、基因治療是指將目的基因用基因轉移技術導入目的細胞進行表達，使其獲得特定的功能，從而達到治療的目的?；蛑委熡扇齻€方面組成：受體細胞、載體以及目的基因。 皮膚成纖維細胞(dermalfibroblasts,DFs)獲取方便，可以在體外大量擴增，容易進行遺傳改造，并且具有容易移植和不易轉化的優(yōu)點，因此DFs成為目前基因治療應用較為廣泛的靶細胞，本論文亦將此細胞作為研究對象。 目前，基因治療面臨的瓶頸問題在于轉染效率低下，而決

2、定基因治療轉染效率的關鍵點之一就在于載體的選擇。目前基因治療所應用的載體主要包括病毒載體和非病毒載體，其中應用最多的是病毒載體，包括逆轉錄病毒，腺病毒，腺相關病毒，皰疹病毒和慢病毒，其中前四種已經被美國FDA批準應用于臨床。在人類基因治療常用的病毒載體中，腺相關病毒(Adeno-associatedviruses，AAV)的安全優(yōu)勢以及長效表達的優(yōu)點使其成為了基因穩(wěn)定轉染的寵兒。而腺病毒(Adenovirus，Ad)載體則因具有感染效率

3、和外源基因表達水平高、高滴度制備較簡單等特點而被廣泛用于基因治療研究和臨床試驗中。因此，本論文選擇AAV和Ad為研究對象。由于病毒載體的衣殼蛋白是決定其對靶細胞嗜性的主要因素，進行衣殼蛋白改造后的載體有望改變載體親嗜性而提高轉染效率。我們在選用常規(guī)使用的AAV2和Ad5的基礎上，還選用了將AAV2的ITRs包被進入AAV1的衣殼蛋白形成的嵌合型載體-AAV2/1，以及將Ad35載體的纖突整合到Ad5載體上形成的Ad5/F35作為研究對象

4、，通過比較他們的轉染效率來篩選適合DFs的載體。 本學位論文以eGFP為報告基因，以流式細胞檢測(flowcytometry，F(xiàn)CM)和熒光顯微照相為研究手段，比較AAV2-eGFP、AAV2/1-eGFP、Ad5-eGFP和Ad5/F35-eGFP對DFs的轉染效率，探討了四種病毒載體轉染DFs的適合條件，同時利用MTT法研究四種病毒載體轉染后DFs的增殖性能，希望篩選出對DFs嗜性較高的載體，同時也進一步為成纖維細胞用于基因

5、治療的規(guī)?；a應用提供實驗和理論依據(jù)。 AAV2-eGFP和AAV2/1-eGFP分別按照轉染倍數(shù)MOI為104、105、106轉染DFs，Ad5-eGFP和Ad5/F35-eGFP按照感染復數(shù)MOI為10、25、50、100轉染DFs，轉染后24h用流式細胞檢測轉染效率，熒光顯微鏡觀察轉染后的熒光強度，MTT檢測兩者對DFs增殖的影響。實驗結果如下： AAV2/1-eGFP對DFs無感染能力，MOI105時AAV2轉

6、染DFs24h后轉染效率可達到(22.16+5.59)％，表明AAV2轉染DFs可以有效獲得皮膚基因修飾細胞，進一步用于基因治療和基因修飾。 Ad5-eGFP和Ad5/F35-eGFP在MOI為10、25、50、100時轉染效率隨著：MOI升高而呈上升趨勢，MOI100時，Ad5/F35-eGFP轉染DFs24h后轉染效率可達到90％左右，Ad5-eGFP達到70％左右。 綜合實驗結果分析，結論如下： Ad5/F