基于體積放大技術(shù)的單個(gè)DNA分子檢測.pdf

1、第一章對單分子檢測及磁球技術(shù)進(jìn)行了綜述。首先介紹了單分子檢測的研究概況，主要包括單分子檢測的主要內(nèi)容、特點(diǎn)和采用的技術(shù)，重點(diǎn)介紹了單分子檢測所采用的技術(shù)，涉及到光學(xué)方法、掃描探針顯微方法和化學(xué)方法。其次介紹了磁球的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了磁球在DNA的分離與檢測、酶的固定化、細(xì)胞分選、免疫檢測等的應(yīng)用。 第二章中用一種新的、簡單的方法檢測單個(gè)pUC19質(zhì)粒DNA分子。首先取一定量的磁球(直徑0.35μm)與過量捕捉探針反應(yīng)，利

2、用磁分離除去過量的捕捉探針，然后將少量目標(biāo)DNA分子與遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量的上述連接有捕捉探針的磁球在雜交緩沖溶液中充分反應(yīng)，這樣一個(gè)目標(biāo)DNA分子通過雜交反應(yīng)會(huì)結(jié)合到一個(gè)磁球上。第二步取一定量的微球(直徑9.95μm)與檢測探針反應(yīng)，通過離心分離、清洗除去過量的檢測探針。第三步將上述兩步反應(yīng)的產(chǎn)物按一定比例混合，進(jìn)行雜交反應(yīng)，最終通過目標(biāo)DNA分子與磁球-微球的聯(lián)結(jié)，形成磁球-目標(biāo)DNA-微球的夾心復(fù)合體。因?yàn)樵谝陨媳壤陆Y(jié)合了檢測探針微球的濃度

3、大大地大于結(jié)合了目標(biāo)DNA磁球的濃度，所以只有一個(gè)結(jié)合了單個(gè)目標(biāo)DNA分子的磁球可以結(jié)合到微球上。用磁分離除去未反應(yīng)的微球，將此溶液清洗后滴加在載玻片上，用倒置顯微鏡以十或二十倍物鏡用或者一百或二百倍物鏡觀察。在顯微鏡下看到的微球，就是一個(gè)磁球-目標(biāo)DNA-微球的夾心復(fù)合體。其觀測到的微球數(shù)目也就是單個(gè)目標(biāo)DNA分子的數(shù)目。這個(gè)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是不需用復(fù)雜而昂貴的儀器，只用普通的顯微鏡配合常用的CCD(也可用目視)就可實(shí)現(xiàn)單個(gè)DNA分子的

4、檢測。 第三章同樣采用了磁/微球技術(shù)的體積放大效應(yīng)，通過增加反應(yīng)時(shí)間和用自制振蕩器改變震蕩條件提高了雜交反應(yīng)產(chǎn)率，以炭疽熱的單個(gè)DNA分子為目標(biāo)，研究了單分子個(gè)數(shù)與濃度的定量關(guān)系。為了準(zhǔn)確、方便地進(jìn)行單分子計(jì)數(shù)，制作了底部刻蝕有坐標(biāo)方格的小池子，然后在倒置顯微鏡下按照坐標(biāo)方格移動(dòng)載物臺，用CCD對每個(gè)小池子進(jìn)行拍照。因?yàn)橛凶鴺?biāo)方格作為參照標(biāo)準(zhǔn)，所以拍出的照片就不會(huì)出現(xiàn)重復(fù)和遺漏。然后再根據(jù)拍出的照片，對微球個(gè)數(shù)進(jìn)行單分子計(jì)數(shù)。對