尿胰蛋白酶抑制劑減輕小鼠肝臟冷缺血再灌注損傷的作用機制研究.pdf

1、目前研究肝臟缺血再灌注損傷通常采用的方法有:(1)對離體或原位肝臟行人工或機械灌注法;(2)肝臟原位熱缺血再灌注法;(3)原位肝臟移植法.各種方法均有利弊.臨床上,隨著取肝技術(shù)的日益成熟,熱缺血時間越來越短,使得冷缺血再灌注損傷備受關(guān)注,許多研究表明:這一事件與移植物的功能發(fā)揮不良,急性排斥反應(yīng),移植物與受體的存活密切相關(guān).為了更便捷肝臟缺血再灌注損傷基礎(chǔ)研究,我們建立了一種小鼠肝臟原位冷缺血再灌注模型來模擬肝臟移植中缺血再灌注過程.結(jié)

2、論:1.阻斷肝下下腔靜脈、肝動脈和門靜脈能保持灌注后肝臟無肝期內(nèi)的無血狀態(tài),2.成功建立小鼠肝臟原位冷缺血再灌注模型,該模型較好地反映了肝臟缺血再灌注損傷后血清酶學(xué)和組織病理學(xué)的動態(tài)變化.第二部分:尿胰蛋白酶抑制劑對小鼠肝臟冷缺血再灌注損傷的保護作用研究; 缺血再灌注損傷是指機體器官組織缺血再灌注恢復(fù)循環(huán)血流后,往往會造成器官功能不良,甚至發(fā)生更為嚴重的組織損傷或器官功能衰竭.肝臟缺血再灌注損傷是一種常見的病理生理過程,臨床上的肝葉切除

3、、以及廣泛的肝外傷手術(shù)等,為了止血,需要臨時阻斷肝臟血流;嚴重的創(chuàng)傷、休克也常導(dǎo)致肝臟血循環(huán)的減少;肝臟移植時,肝臟血流也不可避免的臨時中斷等均可導(dǎo)致這一事件的發(fā)生.因此,力圖減輕缺血再灌注損傷是提高肝移植術(shù)成功率和降低術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的關(guān)鍵途徑.雖然已有許多關(guān)于肝臟的缺血再灌注損傷的機理研究,但目前人們對其真正的分子機制了解尚未完全清楚.現(xiàn)眾多研究發(fā)現(xiàn),肝臟低溫保存再灌注引起的細胞分子變化,是引起早期并發(fā)癥的重要因素之一.肝臟缺血再灌注

4、不僅可以引起肝細胞鈣離子超載、氧自由基和細胞粘附分子的激活、細胞因子釋放、一氧化氮和內(nèi)皮素的變化Kupffer細胞的活化、與微循環(huán)功能不良,而且可直接導(dǎo)致肝細胞的損傷和凋亡. 尿胰蛋白酶抑制劑(UTI)分子中存在多種酶的結(jié)合位點,能夠同時獨立抑制多種酶,包括胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶和纖溶酶等.目前,國內(nèi)多用于胰腺炎、圍手術(shù)期大臟器保護的治療.近年來,國內(nèi)外均有文獻報道其在移植領(lǐng)域的作用,但UTI保護肝臟免受或減輕缺

5、血再灌注損傷作用的機理尚未明確,還需進一步研究探討. 材料與方法:選用8-12周齡25-30g健康雄性BALB/C小鼠作為實驗動物,共分為四組:假手術(shù)組,對照組,預(yù)防組,治療組.按第一部分介紹的方法建立模型.預(yù)防組在肝臟缺血前5min,小鼠尾靜脈內(nèi)注入UTI 50,000U/Kg;治療組在無肝期結(jié)束后30min,小鼠尾靜脈內(nèi)注入UTI 50,000U/Kg.各組再灌注后1h、3h、6h、24h時點獲取肝臟和血液標本.全自動生化分析儀測定

6、血漿中ALT、AST水平;NF-κB和MPO Kit分別檢測肝臟組織中NF-κB含量和MPO活力;TUNEL法檢測肝細胞的凋亡情況;免疫組織化學(xué)、RT-PCR、Western bolt法檢測組織中TNF-α、IκB-α、KC、MIP-2、P-selectin、E-selectin、ICAM-1及iNOS在各時點的蛋白和mRNA表達水平;光鏡下觀察形態(tài)學(xué)改變.統(tǒng)計學(xué)上采用Student's,Mann-Whitney,Chi-Square等

7、檢驗方法.結(jié)果: 再灌注后各時點血ALT、AST水平均明顯升高,術(shù)后6小時達高峰.與假手術(shù)組相比三組ALT、AST水平均明顯增高(分別為317±7Ou/L;257±69 u/L;293±33u/L vs 80±4.2 u/L;P<0.05);預(yù)防組和治療組6h、24h的ALT、AST水平明顯低于對照組(P<0.05);預(yù)防組6h、24h的ALT水平和6h的AST水平均低于治療組(分別為919±250u/L vs 1272±269 u/L

8、;484±63 u/L vs 651±159 u/L;1050±265u/L vs1446±300 u/L;P<0.05).病理學(xué)檢查示,再灌注后6h,對照組組織改變明顯,預(yù)防組和治療組的損傷較輕.TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn),預(yù)防組再灌注后3h、6h、24h的細胞凋亡數(shù)均低于對照組(分別為12.0±7.3個/HP vs 22.3±9.6個/HP;20.5±12.5個/HP vs36.3±18.6個/HP;14.6±8.9個/HP vs 25.

9、3±14.3個/HP;P<0.05);預(yù)防組再灌注后6h時點的細胞凋亡數(shù)低于治療組(為20.5±12.5個/HP vs 32.0±15.4個/HP;P<0.05);肝臟細胞凋亡程度依次為對照組>治療組>預(yù)防組,凋亡高峰發(fā)生在6h時點.免疫組織化學(xué)、RT-PCR、Western bolt法在不同水平檢測上均提示TNF-α、KC、MIP-2、P-selectin、ICAM-1及iNOS在對照組中的表達強于預(yù)防組.IκB-α、E-select

10、in在各組中表達均有升高,但無統(tǒng)計學(xué)差異.NF-κB含量的檢測結(jié)果顯示,再灌注后1h、3h、6h肝臟組織中NF-κB水平逐漸增高,與假手術(shù)組差異有顯著性;預(yù)防組1h、6h的NF-κB水平低于對照組(分別為0.017±0.O09 vs 0.039±0.013;0.067±0.018 vs 0.122±0.040;P<0.05);預(yù)防組1h的NF-κB水平低于治療組(為0.017±0.009 vs 0.035±0.011;P<0.05).M

11、PO的檢測結(jié)果顯示,再灌注后1h、3h、6h肝臟組織中MPO逐漸增高;預(yù)防組1h、6h、24h和治療組6h點的MPO均低于對照組(分別為0.096±0.134u/g vs 0.213±0.349u/g;0.333±0.261u/g vs 0.797±0.400u/g;0.116±0.109u/gvs 0.345±0.222 u/g;0.399±0.269u/g vs 0.797±0.400 u/g;P<0.05).結(jié)論:1.TNF-α、