14-3-3σ在癌前病變及食管鱗癌中表達(dá)的臨床意義及與預(yù)后的相關(guān)性.pdf

1、背景：
　　食管癌(Esophagealcancer，EC)的發(fā)病率和死亡率分別位居全球腫瘤發(fā)病率和死亡率的第八位和第六位，中國每年新確診的EC患者約占全球所有EC的一半。在中國，食管鱗狀細(xì)胞癌（Esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC）是EC主要的組織學(xué)類型，約占全部EC的90％。近年來，盡管ESCC的診斷和治療手段已取得了顯著進(jìn)展，其5年整體生存率仍沒有明顯改善，約為15-25％;然而，及時(shí)治療

2、的早期ESCC患者的5年整體生存率可達(dá)90％以上。在中國，大部分確診的ESCC已發(fā)展至中晚期，癌細(xì)胞已經(jīng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和缺乏有效的治療手段導(dǎo)致大多數(shù)ESCC患者在臨床上確診之后的生存時(shí)間不超過一年，其中60-70％的患者死于全身播散和轉(zhuǎn)移。ESCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多病因、多步驟、涉及多分子的復(fù)雜動(dòng)態(tài)演變過程，盡管前期研究已鑒定了許多與ESCC相關(guān)的分子改變，但是目前仍缺乏ESCC相關(guān)的特異分子改變，尤其是能夠用于高危人群監(jiān)測、早期診斷及預(yù)后評(píng)

3、估的生物標(biāo)志物分子。
　　14-3-3σ，又稱為HME-1（Humanmammary-epithelim-specificmarker1或stratifin），是一新的候選腫瘤抑制基因。在14-3-3蛋白家族中，14-3-3σ與腫瘤的相關(guān)性最為密切。14-3-3σ低表達(dá)見于乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、頭頸部腫瘤等;但是，14-3-3σ的高表達(dá)也見于胰腺癌、結(jié)直腸癌、頭頸部腫瘤、肺癌等，并且是預(yù)后評(píng)估

4、的重要分子標(biāo)志物之一。關(guān)于14-3-3σ與ESCC的相關(guān)性，目前國內(nèi)外報(bào)道較少。14-3-3σ的差異表達(dá)可能是ESCC多階段演進(jìn)過程中的特征性分子變化之一，可能參與了ESCC多階段演進(jìn)過程，是ESCC預(yù)后的分子標(biāo)志物之一。
　　目的：
　　分析正常食管黏膜(Normalesophagealepithelium，NEE)、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(Lowgradeintraepithelialneoplasia，LGIN)、高級(jí)別上皮

5、內(nèi)瘤變(Highgradeintraepithelialneoplasia，HGIN)、不同臨床分期ESCC中14-3-3σ表達(dá)的特征及規(guī)律，確定14-3-3σ表達(dá)變化與ESCC臨床病理特征相關(guān)性，評(píng)價(jià)14-3-3σ在ESCC術(shù)后生存期中的預(yù)警作用，明確14-3-3σ在ESCC多階段演進(jìn)及惡性進(jìn)展過程中的作用，為迸一步明晰ESCC多分子、多階段演進(jìn)的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　1.材料與方法
　　1.1研究對(duì)象
　　8

6、0例凍存的TNMⅠ-Ⅳ期ESCC及切緣組織（每期20例）標(biāo)本來自林州市腫瘤醫(yī)院;50例凍存食管黏膜活檢組織樣本(NEE20例，LGIN17例，HGIN13例)來自河南大學(xué)淮河醫(yī)院;110例固定的食管黏膜活檢組織樣本分別來自河南大學(xué)淮河醫(yī)院和林州市腫瘤醫(yī)院;168例5年隨訪的ESCC術(shù)后患者，其中82例ESCC患者于2003-2008年在河南大學(xué)淮河醫(yī)院接受根治性手術(shù)治療，另86例來自上海芯超生物科技有限公司ESCC組織芯片（于2006-

7、2008年接受根治性手術(shù)治療）。
　　食管黏膜上皮永生化細(xì)胞NEC、EC細(xì)胞系EC1、EC109、EC9706，及EC9706順鉑耐藥細(xì)胞系EC9706/CDDP和紫杉醇耐藥細(xì)胞系EC9706/PTX均用含10％胎牛血清RPMI1640于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。
　　1.2實(shí)驗(yàn)方法
　　1.2.1Westernblot方法
　　應(yīng)用2D裂解液（8Murea、4％CHAPS、40mMDTT、蛋白酶抑制劑）提取

8、冰凍組織（20例NEE、17例LGIN、13例HGIN）、80例ESCC（TNMⅠ-Ⅳ期）及各細(xì)胞系(NEC、EC1、EC109、EC9706、EC9706/CDDP、EC9706/PTX)細(xì)胞蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。40μg蛋白進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉非特異性的結(jié)合反應(yīng)，鼠源的抗人14-3-3σ抗體(1∶5000)4℃過夜孵育，HRP標(biāo)記抗鼠二抗室溫孵育1h，ECL檢測目的

9、條帶;其后檢測β-actin的表達(dá)。應(yīng)用Bio-Rad的QuantityOne進(jìn)行蛋白條帶的半定量分析。
　　1.2.2免疫組織化學(xué)方法
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（Immunohistochemistry,IHC）分析110例活檢組織(包括41例NEE、37例LGIN、32例HGIN)和168例隨訪ESCC組織中14-3-3σ表達(dá)。IHC分析采用卵白素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(ABC)法。
　　1.2.3IHC結(jié)

10、果半定量分析
　　染色強(qiáng)度分為3級(jí)（無染色為0，弱陽性為1，中度陽性為2，強(qiáng)陽性為3），免疫陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分為4級(jí)（陽性細(xì)胞數(shù)＜10％為0，10-25％為1，26-50％為2，51-75％為3，76-100％為4），最終的綜合評(píng)分為染色強(qiáng)度和免疫陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分之積（0-12分）。免疫評(píng)分≤6為低表達(dá)，＞6為高表達(dá)。
　　1.3SVM模型的建立及分類準(zhǔn)確率
　　應(yīng)用Matlab軟件進(jìn)行SVM運(yùn)算，將隨訪資料完整的168例

11、ESCC隨機(jī)分為128例訓(xùn)練集和40例測試集，將訓(xùn)練集128例ESCC所有屬性進(jìn)行各種組合建立最優(yōu)ESCC預(yù)后分類模型，測試集40例ESCC檢驗(yàn)該分類模型對(duì)ESCC術(shù)后生存期預(yù)測的準(zhǔn)確性。
　　1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS17.0軟件。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。Westernblot所得蛋白條帶采用Mann-Whitney測試或Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法。生存曲線采用Kaplan-Me

12、ier法估計(jì)，曲線之間的差異用log-rank檢驗(yàn)測試。各臨床因素對(duì)預(yù)后生存的影響采用Cox回歸模型的分析方法。受試者工作特征(ROC)的曲線下面積(AUC)分析來評(píng)估各臨床病理特征和SVM分類器的預(yù)測效能?？ǚ綑z驗(yàn)或四格表精確檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)14-3-3σ表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系，Gammatest分析14-3-3σ與ESCC演進(jìn)的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為P值小于0.05。
　　2.結(jié)果
　　2.1從NEE發(fā)展至LGIN、HGIN

13、、ESCC，14-3-3σ白表達(dá)逐漸降低，ESCC中14-3-3σ蛋白表達(dá)最低;Gamma檢驗(yàn)分析表明14-3-3σ蛋白表達(dá)與ESCC癌前病變進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)(Gammavalue=-6.163,P=0.000),14-3-3σ表達(dá)在NEEvsHGIN,NEEvsESCC,LGINvsESCC間的表達(dá)差異顯著(P＜0.05);Westernblot結(jié)果表明:與癌旁非癌食管黏膜組織相比，TNMⅠ-ⅣESCC中14-3-3σ表達(dá)顯著降低，并且隨

14、TNM分期進(jìn)展，14-3-3σ表達(dá)依次降低;
　　2.2NEC細(xì)胞未檢測到14-3-3σ蛋白的表達(dá)，而EC1、EC109、EC9706細(xì)胞中均檢測到中等程度的14-3-3σ蛋白表達(dá)，耐藥細(xì)胞EC9706/PTX和EC9706/CDDP的14-3-3σ表達(dá)最高;
　　2.3IHC結(jié)果表明14-3-3σ蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，卡方檢驗(yàn)分析結(jié)果表明14-3-3σ表達(dá)與ESCC分化程度呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05);而與ESCC患者性

15、別、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度無顯著相關(guān)性（P＞0.05）;
　　2.4Kaplan-Meier生存分析表明:14-3-3σ表達(dá)降低與ESCC預(yù)后不良顯著相關(guān)(P＜0.05)，14-3-3σ高表達(dá)及低表達(dá)ESCC患者的5年整體生存期分別為43.47％、25.62％(log-ranktest,x2=8.448,P=0.004);
　　2.5Cox多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析表明:T分期和14-3-3σ是影響ESC

16、C預(yù)后的獨(dú)立因素(P＜0.05);
　　2.6應(yīng)用SVM建立的ESCC預(yù)后SVM分類模型(ESCC-SVM)的最優(yōu)屬性包含性別、年齡、T分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、14-3-3σ，其預(yù)測的ESCC生存期的效能明顯優(yōu)于其他各臨床病理特征。
　　3.結(jié)論
　　3.114-3-3σ蛋白表達(dá)異常發(fā)生于ESCC病變的早期階段，尤其是HGIN，提示14-3-3σ可能成為ESCC早期診斷的分子標(biāo)志物;
　　3.21