紅鰭東方鲀性別相關(guān)分子標(biāo)記的篩選及數(shù)量形態(tài)特征比較.pdf

1、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）為我國(guó)北方地區(qū)的優(yōu)良海水經(jīng)濟(jì)魚類之一。近年來(lái)，對(duì)紅鰭東方鲀?nèi)后w遺傳多樣性以及家系構(gòu)建和培育等方面的研究逐漸增多，然而，與其性別有關(guān)的研究成果很少。本文運(yùn)用多種方法對(duì)紅鰭東方鲀的性別進(jìn)行研究。首先，本文對(duì)魚類性別相關(guān)基因和分子標(biāo)記的研究現(xiàn)狀進(jìn)行概述，為紅鰭東方鲀性別相關(guān)分子標(biāo)記的篩選提供可行方案。緊接著，概括了魚類閾性狀選育的研究進(jìn)展，為紅鰭東方鲀抗逆家系的選育擴(kuò)展思路。其次，本文利用擴(kuò)增片

2、段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）和微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記技術(shù)篩選紅鰭東方鲀性別相關(guān)的分子標(biāo)記，期望通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在其早期生長(zhǎng)階段辨別雌、雄魚，篩選出雄性魚種養(yǎng)殖，對(duì)提高紅鰭東方鲀養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)價(jià)值有重要的現(xiàn)實(shí)意義，也為其性別決定機(jī)制和性別相關(guān)基因的研究奠定基礎(chǔ)。最后，本文基于紅鰭東方鲀的形態(tài)指標(biāo)，采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)紅鰭東方鲀的雌、雄差異進(jìn)行分析，建立鑒別雌、雄差異的數(shù)學(xué)模型，旨在為紅鰭東方鲀繁育和選育過(guò)程中雌、雄性別的鑒別提供方

3、法和理論依據(jù)。
　　本研究的主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1、利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)篩選紅鰭東方鲀性別相關(guān)的分子標(biāo)記。用紅鰭東方鲀雌、雄各5個(gè)個(gè)體篩選16對(duì)AFLP引物組合。在大約800bp處，引物組合（E+2-3，M+2-4）在5個(gè)雄性個(gè)體中都擴(kuò)增出條帶，而在5個(gè)雌性群體中均未擴(kuò)增出條帶。其它15個(gè)選擇性擴(kuò)增引物組合在雌、雄各5個(gè)個(gè)體中沒(méi)有擴(kuò)增出性別特異性條帶。引物篩選結(jié)果顯示，只有一個(gè)引物組合可以作為紅鰭東方鲀

4、性別相關(guān)的候選引物組合。該引物組合在紅鰭東方鲀雌、雄各30個(gè)個(gè)體中的擴(kuò)增情況表明，在800bp附近處，在個(gè)體DNA水平上不存在雌、雄差異，因此，該候選條帶不是紅鰭東方鲀性別相關(guān)AFLP標(biāo)記。嘗試選擇其它DNA標(biāo)記技術(shù)篩選紅鰭東方鲀性別相關(guān)的分子標(biāo)記。
　　2、利用微衛(wèi)星 DNA標(biāo)記技術(shù)篩選紅鰭東方鲀性別相關(guān)的分子標(biāo)記。用雌、雄各30個(gè)個(gè)體構(gòu)建雌、雄基因池，利用66對(duì)微衛(wèi)星引物掃描雌、雄基因池。在雌、雄基因池中擴(kuò)增出差異條帶的引物有

5、8對(duì)。用兩個(gè)各包括30個(gè)雌、雄個(gè)體的群體對(duì)這8對(duì)引物進(jìn)行兩輪個(gè)體驗(yàn)證。結(jié)果顯示：引物f383在雌性群體中只有極個(gè)別(3/30)個(gè)體中擴(kuò)增出條帶，在雄性群體30個(gè)體中有23個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出條帶。引物f383經(jīng)過(guò)2個(gè)紅鰭東方鲀?nèi)后w共120個(gè)個(gè)體的驗(yàn)證，在雌、雄個(gè)體中擴(kuò)增出的條帶都出現(xiàn)差異極顯著的結(jié)果，差異等位基因片段在60個(gè)雌性個(gè)體中出現(xiàn)10次，頻率很低，為16.7％；而在雄性60個(gè)個(gè)體中出現(xiàn)51次，頻率極高，為85.0%。由此可知，引物f38

6、3該位點(diǎn)的差異片段對(duì)紅鰭東方鲀的性別極具雄性偏好性，該位點(diǎn)應(yīng)該與紅鰭東方鲀性別決定區(qū)域存在相關(guān)關(guān)系。對(duì)性別差異條帶切膠回收、克隆和測(cè)序后，通過(guò)Blast比對(duì)，搜索這條序列的同源序列，結(jié)果表明這條序列為公布的紅鰭東方鲀第19號(hào)染色體上的一段，同源性高達(dá)98%，序列的覆蓋率達(dá)100%。
　　3、文本不僅用分子生物學(xué)的方法鑒別紅鰭東方鲀的性別，而且采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)紅鰭東方鲀的雌、雄差異進(jìn)行分析。以紅鰭東方鲀雌、雄群體（72尾）的1

7、7個(gè)比例性狀為分析對(duì)象進(jìn)行研究，主成分分析結(jié)果顯示，主成分分析獲得三個(gè)主成分，貢獻(xiàn)率分別為46.776%、27.668%和7.122%，3個(gè)主成分的積累貢獻(xiàn)率為81.566%，大多數(shù)雌、雄魚在三個(gè)主成分構(gòu)成的三維空間中能分開。逐步判別分析結(jié)果顯示，篩選出2個(gè)比例性狀，即體寬/體長(zhǎng)、體周長(zhǎng)2/體長(zhǎng)，建立了紅鰭東方鲀的雌雄判別模型，對(duì)雌雄個(gè)體的判別準(zhǔn)確率為81.9%。用38尾紅鰭東方鲀樣本進(jìn)行驗(yàn)證，準(zhǔn)確率達(dá)84.2%。方差分析結(jié)果顯示，體寬