小體鱘性別相關基因P450和AR克隆及表達分析.pdf

1、在脊椎動物系統(tǒng)發(fā)育史中，性別決定和性別分化是兩個重要的過程，細胞內(nèi)遺傳物質對高等動物的性別決定影響較大，占有重要地位。而對于魚類等低等脊椎動物，性腺分化受到溫度、光照、激素等多方面的影響。小體鱘（Acipenser ruthenus）隸屬于鱘科（Acipenseridae）鱘亞科（Acipenserinae）,鱘屬（Acipenser），有洄游和定棲兩種類型，主要分布于里海、黑海、亞速海、地中海、歐洲國家和我國的新疆地區(qū)。小體鱘個體小、

2、生長慢、性成熟早，雌魚懷卵量在0.2～7萬粒/kg，是目前鱘養(yǎng)殖業(yè)中良好的雜交親本，適合大水面養(yǎng)殖，具有良好的養(yǎng)殖前景。
　　芳香化酶（P450arom）是脊椎動物體內(nèi)催化雄激素轉化為雌激素的限速酶，其表達高峰期在出生前后，性成熟后降至最低。雌激素在性別分化、生長、發(fā)育、繁殖及雌性性征維持上起重要作用。大多數(shù)脊椎動物中，P450arom由CYP19單基因編碼，魚類中存在兩種不同基因（CYP19a1a和CYP19a1b）編碼的P45

3、0arom，分為性腺型芳香化酶（P450arom A）和腦型芳香化酶（P450arom B）,在組織中的分布也不同。雄激素受體（androgen receptor，AR）是一種配體依賴型受體，通過與雄激素結合發(fā)揮其作用。雄激素是一種類固醇激素，在芳香化酶的作用下轉化為雌激素，是所有雌激素的前體物質。能影響動物的行為及其生殖系統(tǒng)的發(fā)育、分化、成熟和維持。
　　本實驗通過聚合酶鏈式反應（PCR）、RACE以及相對熒光定量等技術克隆得到

4、小體鱘P450和AR基因全長，以及P450和AR mRNA在小體鱘雌性性腺發(fā)育的二期、三期、四期和雄性性腺發(fā)育三期的不同組織中的表達差異，為小體鱘精巢和卵巢發(fā)育的進一步研究奠定基礎，也為該魚的內(nèi)分泌以及生殖調(diào)控提供科學依據(jù)。具體實驗結果如下：
　　1、小體鱘芳香化酶（P450）基因的克隆及表達分析
　　采用同源克隆和RACE的方法，從小體鱘腦中分離得到芳香化酶（P450）基因。P450 cDNA全長1893bp，包括5′端6

5、9 bp的非編碼區(qū)（untranslation region, UTR），1340 bp的開放閱讀框ORF（open reading finder）和3′端455 bp的非編碼區(qū)(不包括ploy A的尾巴)。P450前體蛋白由446個氨基酸組成，理論分子質量為50.11 kD。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)：小體鱘P450與史氏鱘（Acipenser schrenckii） P450同源性最高，達到98％，與鯔魚（Mugil cephalus）、大

6、西洋鱈魚（Gadus morhua）、海鱒（Salmo trutta）、底鳉（Fundulus heteroclitus）等魚類的卵巢型方向化酶（cyp19a1a）的同源性在63%~66%，與鯔魚、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、青鳉（Oryzias latipes）等魚類的腦型方向化酶（cyp19a1b）的同源性在58%~63%。相對熒光定量（RT-PCR）表明

7、：P450 mRNA的表達具有明顯的組織特異性，在雌性二期、三期、四期中，卵巢中P450表達量明顯高于其他組織，其次是腦、肌肉、腎臟，鰓、腸和心臟中的表達量最低。在雄性三期中，表達量最高的是腦，其次是性腺和腎。
　　2、小體鱘雄激素受體（AR）基因的克隆及表達分析
　　采用同源克隆和RACE的方法，從小體鱘二期卵巢中分離得到了雄激素受體（AR）的cDNA序列，AR基因cDNA全長為2953 bp，包括5′端68 bp的非編碼

8、區(qū)（untranslation region, UTR），2528 bp的開放閱讀框ORF（open reading finder）和3′端327 bp的非編碼區(qū)(不包括ploy A的尾巴)。AR前體蛋白由843個氨基酸組成，理論分子質量為94.24 kD。同源比較結果表明，小體鱘AR氨基酸序列與其他魚類的AR氨基酸序列同源性較高，與雜交鱘（Acipenser ruthenus x Huso huso）、西伯利亞鱘（Acipenser