版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、目的: 1992年,美國NIH批準了第一個神經(jīng)分子外科臨床方案,即運用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Retrovirus,RV)介導(dǎo)單純皰疹病毒胸苷激酶基因/環(huán)丙氧苷(HSR-tk/GCV)系統(tǒng)治療腦膠質(zhì)瘤,在全球范圍內(nèi)引起了醫(yī)學(xué)界人士對惡性腫瘤基因治療的廣泛關(guān)注。目前世界上共有232項基因治療臨床試驗方案獲準進行,其中105項是針對惡性腫瘤的基因治療,14項是針對腦膠質(zhì)瘤,但至今取得理想治療效果的報道甚少。隨著人腦膠質(zhì)瘤基因治療的基礎(chǔ)及臨床
2、研究不斷發(fā)展,越來越多的聯(lián)合治療方案的提出,將為人腦膠質(zhì)瘤的治療提供全新的模式。本研究旨在構(gòu)建一種安全、無輔助病毒污染的、無病毒基因的新型rAAV病毒載體,驗證其轉(zhuǎn)染效率。在此基礎(chǔ)上進一步驗證該載體攜帶血管抑素基因和野生型p53基因在體內(nèi)條件下聯(lián)合治療惡性膠質(zhì)瘤的效果,探索一套安全、有效治療膠質(zhì)瘤的基因治療方法。 研究分三步進行: 1.重組腺病毒相關(guān)病毒(reconstruct adenovirus-associated
3、 virus,rAAV)-陽離子脂質(zhì)體(LyoVec)載體的構(gòu)建及評價本研究構(gòu)建了rAAV-GFP無病毒基因的且無輔助病毒污染的病毒載體、rAAV-GFP-LyoVec新型載體,體外實驗測定此兩種載體及LyoVec-GFP對定量C6細胞的轉(zhuǎn)染率,篩選并確定高轉(zhuǎn)染率載體,按產(chǎn)業(yè)化標(biāo)準進一步完善其構(gòu)建方式,為該載體攜帶血管抑素和野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤做準備。 2.裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型的建立及鑒定裸鼠腫瘤模型是人們研究人類腫
4、瘤生物特性以及腫瘤治療常用的實驗?zāi)P?,適用于異種動物組織的移植和人類腫瘤異種移植。這種模型可以保持原發(fā)腫瘤本身所具有的形態(tài)特征和遺傳性。本實驗為研究人腦膠質(zhì)瘤的基因治療效果建立了裸鼠C6膠質(zhì)瘤的模型,體內(nèi)、體外實驗免疫組化檢測GFAP蛋白的表達,鑒定其遺傳性,研究其病理組織學(xué)特征。 3.rAAV-LyoVec高轉(zhuǎn)染率載體介導(dǎo)血管抑素及野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤用rAAV-LyoVec載體介導(dǎo)血管抑素基因及野生型p53基因
5、聯(lián)合治療C6膠質(zhì)瘤.觀察所構(gòu)建的裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型中各組不同時間段腫瘤體積變化,免疫組織化學(xué)分析血管抑素基因、野生型p53基因及相關(guān)蛋白的表達,電鏡觀察C6細胞凋亡、病毒轉(zhuǎn)染、組織壞死等情況,RT-PCR確認血管抑素基因在分子水平表達。 實驗材料及方法: 1.rAAV-LyoVec載體的構(gòu)建及評價 1.1無病毒基因的病毒載體構(gòu)建: 通用型AAV載體pSNAV、含GFP基因表達盒的AAV載體質(zhì)粒的構(gòu)建采用文
6、獻方法進行,得到的重組質(zhì)粒為pSNAV-GFP,轉(zhuǎn)染的293細胞,將其進行G418抗性篩選,得細胞株命名為293-SG1。293-SG1在37℃5%CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后,搜集細胞,低速離心,去上清,將細胞團快速凍融3次,裂解液在55-60℃加熱30min以滅活殘存腺病毒,低速離心去除細胞碎片得rAAV-GFP粗提物,純化后,按照氯仿處理-PEG/NaCI沉淀-氯仿抽提濃縮法進一步純化,收集細胞及培養(yǎng)液,加入10%體積的氯仿,劇
7、烈振搖,加入固體NaCI至終濃度為1mol/L,離心,收集上清,加入PEGS000至終濃度為10%,離心,棄上清,用PBS重懸沉淀,加入DNaseI至終濃度為1ug/ml,氯仿抽提,收集水相即為純化的rAAV-GFP。 1.2 rAAV-GFP-LyoVec新型載體的構(gòu)建準備rAAV-GFP 80ul,加入RPMI 1640液320ul,LyoVec2ml,取TMAG:DLPC:DOPE摩爾比率是1:2:2(總量是1umol),
8、溶解在0.5ml氯仿中,溶劑蒸發(fā),脂膜浸濕在0.2ml含有1.5×10<'8>rAAV-GFP粒子的PBS溶液中,用渦輪攪拌器混合攪拌2min,懸浮體積用PBS溶液調(diào)到0.5ml,未捕獲rAAV-GFP的LyoVec載體通過浮選轉(zhuǎn)移到Ficoll梯度上.此0.5ml溶液含有rAAV-GFP聯(lián)接LyoVec,它包括1.5×10<'8>rAAV-GFP粒子/umol脂質(zhì)。 脂質(zhì)體的數(shù)量已控制在15nmol/ml脂質(zhì)(1.5×10<'
9、8>粒子/ml),至此含1.5×10<'8>rAAV-GFP-LyoVec粒子新型載體0.5ml構(gòu)建完畢.放入37℃ 5%CO培養(yǎng)箱保存。 1.3 rAAV-GFP,LyoVec-GFP,rAAV-GFP-LyoVec新型載體三組體外轉(zhuǎn)染定量C6細胞,倒置熒光顯微鏡記數(shù),轉(zhuǎn)染率比較。 2.裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型的建立及鑒定 2.1動物:6只15周雌性裸鼠,體重15-20g,購于中國醫(yī)科大學(xué)動物部。 2.2細胞
10、培養(yǎng):大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)在含10%血清的DMEM培養(yǎng)基(青霉素105u/L,鏈霉素100mg/L)中,置于37℃、5%CO<,2>培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期。 2.3瘤細胞懸液接種法:取對數(shù)生長期細胞,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,離心棄上清,用無血清培養(yǎng)液DMEM離心洗滌2次,計數(shù)細胞數(shù),調(diào)整細胞濃度,將細胞懸浮于PBS(0.01mol/L pH7.4)中,細胞濃度為5×10<'6>/ml。抽取細胞懸液200ul(1×10<'6>
11、個),接種6只裸鼠的腋下。 2.4腫瘤的觀察和測量裸鼠接種完畢后,置恒溫(25±2℃)、恒濕(45%~50%)、無菌凈化屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng),定期觀察裸鼠精神、飲食和排便。三維卡規(guī)測量:V(cm<'3>)=,πD<'3>/6(D為腫瘤最大及最短徑的平均值),繪制裸鼠瘤體體積-時間曲線。 2.5病理組織學(xué)檢查處死裸鼠,觀察移植瘤的形態(tài)。取腫瘤組織固定于10%福爾馬林溶液中,石蠟包埋,組織切片,常規(guī)HE染色,組織病理檢查。
12、 2.6免疫組化檢測GFAP蛋白的表達取體外培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細胞爬片以及裸鼠移植瘤組織,免疫組化(ABC法)檢測GFAP蛋白的表達,陽性細胞呈現(xiàn)胞漿棕黃色著染,胞核蘇木精復(fù)染。 3.rAAV-LyoVec高轉(zhuǎn)染率載體介導(dǎo)血管抑素及野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤 3.1 取36只C6膠質(zhì)瘤模型裸鼠,隨機分為6組,每組各6只: 1組PBS空白對照2組LyoVec對照3組rAAV-p53-LyoVec4組rAAV-
13、angiastain-LyoVec5組rAAV-p53-LyoVec+rAAV-angiastain-LyoVec6組卡鉑組(澳大立亞科鼎公司提供)C6細胞懸液接種法接種4d后,各組鼠均已成瘤,瘤體內(nèi)注射治療,1組各鼠分別加入PBS 50ul,2、3、4、5組按50ul/只(1.5×10<'8>粒子/ml)注射各組基因,6組按0.3mg/20mg體重(10mg/ml)注射,每24h注射一次,分別在4d,12d,20d,28d,36d測量
14、成瘤體積。三維卡規(guī)測量:V(cm<'3>)=,πD<'3>/6,D為腫瘤最大及最短徑的平均值。 3.2 免疫組織化學(xué)檢測及HE染色:取各組C6移植瘤,常規(guī)脫水,透明,石蠟包埋封固,切片,免疫組化SABC法檢測各組膠質(zhì)瘤內(nèi)p53,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),CD34蛋白產(chǎn)物的表達。 3.3 RT-PCR進一步測定angiastain各組C6轉(zhuǎn)染細胞中分子水平表達引物由中科院上海生物工程公司合成。 提取4、5兩組C
15、6轉(zhuǎn)染細胞胞漿中的RNA及poly(A)+RNA,然后進行cDNA合成,將cDNA直接用于PCR擴增,反應(yīng)結(jié)束后,樣品4℃保存。取5ul反應(yīng)液置瓊脂糖凝膠電泳,經(jīng)溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。 實驗結(jié)果: 1.rAAV-LyoVec載體的構(gòu)建及評價1.1成功構(gòu)建rAAv-GFP LyoVec新型載體,1.2 rAAV-GFP,LyoVec-GFP,rAAv-GFP-LyoVec三組載體體外轉(zhuǎn)染C6細胞,MOI(mul
16、tiplicity of infection)為10<'5>v.g/cell。即病毒基因組數(shù)(v.g)與轉(zhuǎn)染細胞之比為10<'5>。倒置熒光顯微鏡記數(shù),轉(zhuǎn)染率比較.rAAV -GFP-LyoVec組高于rAAV-GFP組和LyoVec-GFP組。 2.裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型的建立及鑒定建立了裸鼠C6膠質(zhì)瘤模型,裸鼠的腋下移植瘤生長潛伏期為4天,繪制裸鼠腫瘤體積-時間生長曲線。 3.rAAV-LyoVec高轉(zhuǎn)染率載體介導(dǎo)血管抑
17、素及野生型p53聯(lián)合基因治療C6膠質(zhì)瘤 3.1 建立了腫瘤體積-時間生長曲線。 3.2 免疫組織化學(xué)檢測及HE染色顯示,各組細胞p53、VEGF及CD34蛋白均有不同程度的表達。 3.3 在4、5組經(jīng)RT-PCR獲得一個基因片斷,電泳證實為angiastain基因片斷,其它組未見。 結(jié)論: 1.新構(gòu)建rAAV-LyoVec載體基因的轉(zhuǎn)染效率遠遠高于rAAV或LyoVec獨立轉(zhuǎn)染。 2.裸鼠
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 重組腺病毒介導(dǎo)人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因治療膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf
- 人腦膠質(zhì)瘤EGFR和p53基因表達以及EGFR反義RNA與p53基因聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)對膠質(zhì)瘤生長抑瘤作用的研究.pdf
- p53基因治療聯(lián)合化療或放療對膠質(zhì)瘤作用的實驗研究.pdf
- 基因治療增敏伽瑪?shù)斗派渫饪浦委熌z質(zhì)瘤的初步研究:過表達野生型p53和靶向Ku70的RNA干涉.pdf
- 熱療聯(lián)合瘤內(nèi)注射野生型p53治療肝癌的實驗研究.pdf
- 自殺基因HSV-TK、野生型P53基因治療實驗性肝癌.pdf
- 野生型P53基因轉(zhuǎn)染對SHG-,44-膠質(zhì)瘤細胞惡性表型及凋亡的影響.pdf
- 化療藥物聯(lián)合野生型p53基因抑制Hela細胞的研究.pdf
- 野生型p53基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合光動力療法對肺癌治療作用的實驗研究.pdf
- 野生型p53基因抑制Hela細胞生長的研究.pdf
- 超聲微泡介導(dǎo)野生型p53基因轉(zhuǎn)染鼠視網(wǎng)膜母細胞瘤的實驗研究.pdf
- 野生型p53基礎(chǔ)治療涎腺腺樣囊性癌的實驗研究.pdf
- 超聲微泡介導(dǎo)野生型p53基因轉(zhuǎn)染Y79細胞的實驗研究.pdf
- Survivin、P53基因在膠質(zhì)瘤組織中表達的研究.pdf
- 抗腫瘤血管新生基因治療腦膠質(zhì)瘤的臨床基礎(chǔ)研究.pdf
- BMSCs作為腦膠質(zhì)瘤基因治療的載體的可行性研究.pdf
- 基因重組野生型p53腺相關(guān)病毒治療膀胱癌的實驗研究.pdf
- 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的抗膠質(zhì)瘤血管形成基因治療.pdf
- miR-21基因治療聯(lián)合化療抑制腦膠質(zhì)瘤的時序效應(yīng)研究.pdf
- 抗血管生成基因治療人腦膠質(zhì)瘤的實驗研究.pdf
評論
0/150
提交評論